Identificação de espécies em ovos de aves apreendidos em situação de comércio ilegal : aporte para aplicação da técnica de DNA barcode

Abstract

O comércio ilegal de animais silvestres é uma das grandes ameaças à biodiversidade sendo que, no Brasil, as aves são os animais mais visados. O modus operandi do tráfico de aves foi sendo alterado ao longo do tempo e, atualmente, a retirada de ovos diretamente dos ninhos é bastante praticada. Após apreensão, os ovos podem apresentar-se em condições diversas: fecundado ou não, em decomposição, dessecado ou, muitas vezes, não estar inteiramente disponível, dispondo-se apenas de alguns vestígios, como cascas quebradas. Tais situações podem limitar a disponibilidade de DNA ou torná-lo altamente degradado. Este estudo objetivou a proposição de um protocolo padrão a ser utilizado na identificação de espécies de aves em ovos apreendidos em quaisquer situações. Foram realizadas análises in silico para determinar os tamanhos de fragmentos do gene citocromo oxidase I (COI) que podem ser bons marcadores buscando verificar a utilidade de um marcador de DNA para identificação de espécies de psitacídeos, um dos grupos cujos ovos são alvos frequentes do tráfico no Brasil. A partir desses resultados, foram definidos primers para os fragmentos de COI de 164, 405 e 747 pares de base (pb) para utilização na padronização de protocolos de análise de DNA em ovos. Foi padronizado um protocolo de extração e amplificação de DNA a partir de ovos de codorna. Em seguida, o protocolo foi testado em ovos submetidos a diferentes condições adversas que podem ocorrer a partir do tráfico: ovos dessecados, em decomposição, cascas de ovos quebradas e fluido de ovo depositado em diferentes substratos. Em todas as situações simuladas foi possível amplificar mini-barcodes (164 pb), sendo necessário o uso de DMSO 3% como adjuvante na PCR em algumas amostras, principalmente de cascas quebradas. A amplificação de fragmentos barcode (947 ? tamanho maior para codorna em relação à maioria das aves ? e 405 pb) obteve menor sucesso em amostras de ovos em decomposição, cascas quebradas e fluido de ovo em quatro dos oito substratos testados, podendo ser um indicativo de degradação do DNA. Por fim, o protocolo foi aplicado em amostras de ovos apreendidos pela Polícia Federal resultando na identificação de 30 dos 31 ovos analisados como Graydidascalus brachyurus (curica-verde). Assim, o protocolo desenvolvido neste estudo se mostrou uma ferramenta amplamente aplicável e funcional que pode auxiliar no combate a crimes contra a fauna.

Abstract: The wildlife ilegal trade is one of the current major threats to biodiversity and in Brazil birds are the animals more aim for this activity. The birds illegal trade?s modus operandi was altered over time. Currently, the withdrawal of eggs directly from the nests is fairly frequent. After seizure, eggs may be presented under different conditions: fertilized or not, rotten, dry or, often, not entirely available, with only a few trace, such as broken shells. Such situations may limit the DNA availability or make it highly degraded. This study aimed proposing a standard protocol to be used in the bird species identification in seized eggs in any situations. In silico analyzes were performed to determine the cytochrome oxidase I (COI) fragments sizes which can be good markers in order to check the usefulness of a DNA marker for psittacines species identification, one of the groups whose eggs are highly targeted by trafficking in Brazil. From these results, primers were defined for the COI fragments of 164, 405 and 747 base pairs (bp) for use in the eggs DNA analysis standardization. A DNA extraction and amplification protocol was standardized from poultry eggs previously approved as the biological model of the study. The protocol was then tested on eggs subjected to different adverse conditions that may occur as: dried and decomposing eggs, broken egg shells and egg fluid deposited on different substrates. In all simulated situations it was possible to amplify mini-barcodes (164 bp), requiring the use of 3% DMSO as an PCR adjuvant in some samples, mainly broken shells. Barcode fragments amplification (947 ? larger size for quail compared to most birds ? and 405 bp) was more compromised in samples of rotten eggs, broken shells and egg fluid on four of the eight substrates tested, possibly because the DNA degradation. The protocol was applied in samples of seized eggs by the Federal Police resulting in identification success of 30 of the 31 eggs analyzed as Graydidascalus brachyurus (short-tailed parrot). Thus, the protocol developed in this study proved to be a widely applicable and functional tool wich can assist to combat wildlife crimes.