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O câncer de mama é responsável por um grande impacto na saúde mundial. Esse é o tipo de câncer mais frequente em mulheres, e afeta milhões de pessoas no mundo, com uma taxa de mortalidade alta. Trata-se de uma doença heterogênea, composta por distintos subtipos histológicos e biológicos, os quais representam diferentes formas clínicas e de evolução da doença, e, assim, acarretam em desafios quanto ao diagnóstico e tratamento da mesma. Atualmente, o diagnóstico do câncer de mama requer o uso da avaliação imuno-histoquímica da amostra do tecido mamário, porém, algumas limitações estão associadas ao seu uso, como o tempo longo de processamento, uso limitado de marcadores por amostra e quantidade baixa de células analisadas. Assim, novas ferramentas de diagnóstico laboratorial são necessárias para auxiliar o diagnóstico precoce, como o uso de tecnologias inovadoras e de biomarcadores adequados, que possibilitam a tomadas das melhores condutas clínicas. Nesse contexto, a citometria de fluxo é uma metodologia rápida, eficiente e precisa que pode contribuir com os requisitos citados acima. Recentemente, alguns biomarcadores de diagnóstico e prognóstico, como o PDL1, PD1, CTLA-4, CK19 e o CD8 vem sendo investigados em pacientes com câncer de mama, mas associações entre esses biomarcadores ainda não foram investigadas. Assim, o objetivo do projeto é avaliar a importância da análise conjunta dos biomarcadores RE, RP, HER2, Ki67 com o CK19, CD8, PDL1, PD1 e CTLA-4 para o diagnóstico, prognóstico e avaliação do risco de metástase em pacientes com câncer de mama; e do plano de atividades do bolsista foi validar a imunofenotipagem por citometria de fluxo dos biomarcadores CK19 e PDL1 para a investigação de diagnóstico e prognóstico para o câncer de mama. Para atingir esses objetivos, foi realizada a titulação e validação dos anticorpos anti-CK19 e anti-PDL1 em células de linhagem de câncer de mama MDA-MB-231 e MCF-7. Para a marcação das amostras foi utilizada a técnica de marcação direta de antígenos de superfície e para as proteínas intracelulares (CK19) foi utilizada a técnica de marcação intracitoplasmática com o auxílio do kit FIX&PERM®. Além disso, foi avaliada a sensibilidade de recuperação de células neoplásicas PDL1+ no sangue periférico pelos métodos de Ficoll-hypaque e Bulk-lysis. Os resultados mostram que após marcação com o anti-PDL1 causou aumento de aproximadamente quatro vezes da intensidade de fluorescência média (IFM) nas células MC7 marcadas em relação ao controle de células não marcadas (controle negativo) com um volume de 20 µL. Já a marcação das células MCF-7 com 2,5 µL e 5,0 µL de anti-CK19 mostrou um aumento aproximado do IFM de 59 e 65, respectivamente, em relação ao controle. Assim, optou-se pela utilização de 2,5 µL desse anticorpo, pois as células positivas ficaram bem separadas das negativas (controle). Em relação a padronização de células CK19 e PDL1 positivas no sangue periférico para investigação de êmbolos neoplásicos na circulação periférica, foi observado que a metodologia Bulk-lysis foi mais eficiente para detectar as células neoplásicas circulantes. Por fim, foi possível validar o uso da concentração de 20 µL para o anticorpo anti-PDL1 e de 2,5 µL para o anticorpo anti-CK19. O Bulk-lysis foi selecionado como a metodologia a ser utilizada para a detecção de êmbolos neoplásicos na circulação periférica, e definido a aquisição de pelo menos 5 x 106 de eventos em cada tubo. Após essa etapa de padronização, os biomarcadores poderiam ser avaliados em amostra de pacientes, entretanto, em virtude da pandemia do novo coronavírus (Sars-CoV-2) houve a paralização das coletas de amostra no Hospital Universitário/UFSC/EBSERH. |
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