Caracterização funcional da proteína CHAP1 de Trypanosoma cruzi

Abstract

O Trypanosoma cruzi é o protozoário agente etiológico da Doença de Chagas. Esse parasito possui um ciclo de vida heteroxênico, compreendendo um hospedeiro mamífero e um inseto vetor. Para estabelecer a sua infecção e manter o seu metabolismo, o T. cruzi precisa estabilizar os níveis de espécies reativas de oxigênio (ERO) e espécies reativas de nitrogênio (ERN) provenientes do sistema imune de seus hospedeiros, bem como produzidos de forma intrínseca. Para não sofrer com esse estresse oxidativo e nitrosativo, o T. cruzi possui um sistema antioxidante exclusivo baseado na tripanotiona, um tiol formado por duas glutationas e uma espermidina, que por sua vez é sintetizado por uma reação de duas etapas, ambas catalisadas pela enzima tripanotiona sintetase (TryS). Essa enzima se mostra como essencial para o metabolismo do parasito. Em estudos do nosso grupo de pesquisa, foi verificada a presença de duas sequências anotadas nos bancos de dados de tripanosomatídeos como TryS, porém elas não possuem o domínio de síntese, apenas o domínio CHAP e por essa razão essas sequências foram renomeadas como TcChap1 e TcChap2. A TcCHAP1 difere da TryS por ser menor e possuir endereçamento para mitocôndria. Assim, não está clara a função desta proteína e, portanto, o objetivo deste trabalho é a caracterização funcional da proteína CHAP1 de T. cruzi. Inicialmente, foi realizada a expressão heteróloga de um fragmento proteico da proteína TcCHAP1, visando a posterior produção de um anticorpo policlonal, no entanto apesar dos diversos testes de expressão realizados não foi possível obter a proteína recombinante. No memento, estamos testando outras alternativas para expressão. Em paralelo foi construído um plasmídeo com o intuito de fazer a superexpressão da TcCHAP1 no parasito. Este plasmídeo foi usado na transfecção de T. cruzi e apesar de ainda estar em fase de seleção por antibiótico já é possível observar a expressão do gene repórter mNeonGreen. Além disso, foram realizadas as primeiras etapas para a deleção do gene que codifica para TcCHAP1, que inclui o desenho dos iniciadores necessários para a construção dos sgRNAs e os cassetes de reparo para TcChap1, assim como a transfecção com o mix de deleção. Após a seleção dos parasitos transfectados não foi possível observar a deleção do gene.