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Abstract:
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Amebas de vida livre do gênero Acanthamoeba são amplamente distribuídas no ambiente e relacionadas a infecções no homem. A ceratite amebiana (CA) é a infecção mais comum, atinge principalmente usuários de lentes de contato, associado ao mal uso e higienização das lentes e estojo. A CA é uma doença ocular de difícil tratamento, que em casos graves, pode evoluir para a perda de visão. Acanthamoeba spp. apresentam-se sob duas formas em seu ciclo de vida, a trofozoítica, metabolicamente ativa e a cística, resistente em condições desfavoráveis. Sabe-se que o principal esterol presente na membrana de cistos e trofozoítos de Acanthamoeba spp. é o ergosterol, representando 5% do total de lipídios em trofozoítos e 3% em células encistadas. Os tratamentos para CA são inespecíficos, com atividade anti-trofozoíto, e pouco efetivos contra os cistos. O presente trabalho teve como objetivo a aplicação de um sistema nanocarreador de pequenos RNAs de interferência (siRNA) no silenciamento da via de síntese do ergosterol no controle do encistamento de Acanthamoeba castellanii. Nanopartículas (NPs) previamente desenvolvidas por Mello Junior (2016), foram utilizadas para carreamento de siRNAs específicos para silenciamento de uma enzima envolvida na síntese do ergosterol de A. castellanii. A construção das sequências de siRNA seguiram critérios pré-estabelecidos por Reynolds et al. (2004). Para os ensaios de atividade biológica, padronizou-se o melhor meio para encistamento para A. castelanii T4 (ATCC50492), avaliados nos intervalos de 24, 48, 72, 96 e 144 horas. A citotoxicidade da formulação de NPs foi avaliada frente aos trofozoítos nos meios DMEM, RPMI, PYG e NEM. A viabilidade foi determinada por contagem em câmara de Fuchs-Rosenthal utilizando o corante de viabilidade azul de tripan (0,4%) após os períodos de 24 e 48 horas de incubação. A internalização das NPs e escape endossomal nos trofozoítos foram observados por microscopia confocal. Dos resultados obtidos, o meio NEM foi selecionado como o mais efetivo para indução do encistamento. O meio PYG foi escolhido para ensaios com trofozoítos frente às formulações de NPs, com necessidade de purificação, evitando a formação de agregados. As imagens por microscopia confocal sugerem a eficiência do nanocarreador na internalização das NPs contendo siRNA em A. castelanii. Até o presente momento, este trabalho mostrou a eficiência de um sistema nanocarreador de transportar pequenos RNAs de interferências em A. castellanii, além de padronizar meios de encistamento e avaliar a estabilidade do nanocarreador em diferentes meios. Devido à situação que acomete o Brasil e mundo causado pelo vírus SARS-CoV-2 ,experimentos previstos no plano de atividades foram adiados, visando a segurança e saúde dos pesquisadores, em contrapartida atividades de seminários, trabalhos e discussão de grupo estão sendo realizados via remoto no período de isolamento. Espera-se a realização das próximas etapas previstas no plano de trabalho para obtenção de resultados que demonstrem a eficiência de silenciamento na síntese de ergosterol pelo sistema de NPs proposto, com inibição da formação de cistos e diminuição da viabilidade dos trofozoítos. |
