SynPlast: entendendo plasticidade metabólica em biologia sintética - Desenvolvimento de um modelo vegetal para análise de edição de genomas via CRISPR

Abstract

A tecnologia CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) é o sistema de manipulação genética que utiliza nucleases sintéticas e que está se tornando muito popular nos dias de hoje devido ao seu fácil design. Ela surgiu como uma ferramenta poderosa para modificação específica do genoma em praticamente qualquer espécie. A ferramenta é composta por uma enzima endonuclease denominada Cas9 (cliva o DNA) e uma fita de RNA guia (gRNA), que juntos formam um complexo ribonucleoproteico que funciona como uma sentinela, direcionando a enzima ao local de homologia no genoma. Existem ainda diversas lacunas no conhecimento sobre como o sistema CRISPR/Cas9 interage com os mecanismos naturais de reparo do DNA, qual a frequência e a amplitude dos efeitos fora do alvo (off-target), e qual o impacto da exposição de células vegetais ao sistema CRISPR durante longos períodos de tempo. A partir disso, este projeto tem como objetivo o desenvolvimento de um modelo celular vegetal para análise de edição de genomas via CRISPR que comtempla a identificação de mutações fora do alvo e potenciais distúrbios metabólicos oriundo dos mesmos. A metodologia do projeto envolve técnicas da cultura de tecidos para a obtenção de protoplastos de Arabidopsis (ecotipo Columbia-0), nos quais serão feitas a transformação genética (“edição de genes”) sem a utilização de um vetor. Desta maneira, a transfecção do complexo ribonucleoproteico da Cas9 para as células foi realizada através de polietilenoglicol (PEG). Foram utilizados softwares de predição de sítios não-alvo que utilizam a sequência do RNA guia para buscar regiões com homologia no genoma hospedeiro. Foram escolhidas vinte e duas sequencias para o design e sintetize de primers para posterior sequenciamento (Sanger) e confirmação de tais mutações. Ainda, os potenciais distúrbios metabólicos serão analisados através da expressão gênica (transcriptoma). Até a finalização deste relatório foi possível ajustar condições de crescimento in vitro, como temperatura e fotoperíodo para a germinação e crescimento da Arabidopsis. Além de resultados preliminares que confirmam a obtenção de protoplastos viáveis dessa planta. Desta forma, a densidade celular, o número de células vivas e a porcentagem de viabilidade das células foram adequadas conforme o descrito na literatura. Também, foram identificados 2.034 (dois mil e trinta e quatro) possíveis off-targets através da análise do software CasOFFinder, dentre os quais 22 foram selecionados para o desenho dos primers que serão utilizados em futuras análises de sequenciamento. Os ensaios realizados até o momento mostram que a qualidade do material biológico como viabilidade das sementes, condições de crescimento e estado fisiológico da planta são fundamentais para o sucesso de protoplastos sadios para extração e posterior edição. Apesar de obter protoplastos viáveis, é necessário aperfeiçoar a técnica de extração de protoplastos para conseguir um maior volume de amostra, testando variações de densidade celular com volume de solução enzimática. Por fim, esse projeto me proporcionou agregar mais conhecimento sobre essa nova tecnologia de edição de genes, incluindo métodos e protocolos de cultura de tecidos e a aprendizagem de uma ferramenta de bioinformática como o CasOFFinder. As próximas atividades incluem o ensaio final com análises de PCR e sequenciamento de regiões off-target, e extração de RNA para posterior análise de transcriptoma utilizando a abordagem de Next Generation Sequencing (NGS).