Clonagem de transportadores de açúcares oriundos de Spathaspora arborariae em linhagem recombinante de Saccharomyces cerevisiae

Abstract

O etanol de 2ª geração (2G) é uma alternativa energética que diminui os impactos ambientais gerados pela utilização dos combustíveis fósseis. A xilose é o segundo monossacarídeo em abundância na biomassa lignocelulósica, sendo assim, sua eficiente fermentação é necessária para que se estabeleça a produção industrial de etanol 2G. Entretanto, a levedura Saccharomyces cerevisiae, que é o organismo melhor adaptado para as condições industriais, não é capaz de utilizar essa pentose. Assim, é necessária a utilização de uma cepa recombinante que possua as proteínas necessárias para a metabolização de xilose. O primeiro passo na via de metabolização é a internalização do sacarídeo, feito por meio de transportadores. Vários organismos metabolizam xilose eficientemente e possivelmente apresentam genes que codificam transportadores dessa pentose. Um desses organismos é a levedura Spathaspora arborariae, isolada no Brasil em troncos em decomposição. Essa levedura teve seu genoma sequenciado, revelando possuir dez possíveis transportadores de sacarídeos. Desses, quatro foram previamente caracterizados, não apresentando atividade sobre xilose, restando seis transportadores que possivelmente possuam atividade sobre esse monossacarídeo. O objetivo deste trabalho foi clonar genes de Sp. arborariae preditos como transportadores de sacarídeos e expressá-los em S. cerevisiae, caracterizando a capacidade de crescimento e fermentação das linhagens obtidas em diferentes sacarídeos (maltose, glicose, xilose e sacarose). Para tal, dois dos seis genes que codificam transportadores sacarídeos de Sp. arborariae que ainda não haviam sido caracterizados foram amplificados a partir do genoma dessa levedura. Em seguida, ambos os genes foram inseridos em plasmídeos que promovem expressão constitutiva. Cada plasmídeo foi inserido em linhagem de S. cerevisiae hxt-null capaz de metabolizar xilose, permitindo a caracterização desses transportadores com base em experimentos de crescimento e fermentação, determinando o consumo de sacarídeos, produção de etanol e outros metabólitos. As linhagens contendo os genes SaXUT1 e tSaXUT1 também foram testadas quanto à suas capacidades de fermentação simultânea de sacarose e xilose. A linhagem contendo o gene SaT10 apresentou capacidade de crescimento e fermentação tanto de glicose quanto de xilose, indicando que esse transportador é um transportador de glicose não seletivo. A linhagem contendo o gene SaT8 foi capaz de fermentar glicose apesar de seu crescimento nessa fonte de carbono não ter sido observado. Com o intuito de simular condições de produção de etanol 2G integrada à produção convencional de etanol (1G), foram testadas as capacidades de co-fermentação de xilose e sacarose pelas linhagens de S. cerevisiae desenvolvidas, além das linhagens contendo o gene SaXUT1 e sua versão truncada (tSaXUT1). Os resultados mostraram que a capacidade fermentativa tanto de glicose quanto de xilose é prejudicada em ambas as linhagens na presença de frutose no meio, proveniente da hidrólise extracelular da sacarose. Portanto, a capacidade de internalização de xilose por Sp. arborariae deve ser reflexo da atividade de algum de seus outros transportadores de açúcares.<br>

Abstract : Second-generation (2G) ethanol is an alternative energy that reduces the environmental impacts generated by the use of fossil fuels. Xylose is the second most abundant sugar present in the lignocellulosic biomass, thus, an efficient fermentation is necessary to establish an industrial production of 2G ethanol. However, the yeast Saccharomyces cerevisiae, which is the best suited organism for utilization on industrial conditions, is not capable of using this pentose. So, it is necessary to use a recombinant strain which possesses the proteins necessary for the metabolism of xylose. The first step in the metabolization pathway is the internalization of sugar, which is done by transporters. Several organisms efficiently metabolize xylose, and possibly have genes encoding transporters of this pentose. One of this organisms is the yeast Spathaspora arborariae, isolated in Brazilian rotting wood. This yeast had its genome sequenced, revealing to have ten possible sugar transporters. Of these transporters, four were previously characterized and had no activity on xylose, remaining six transporters that possibly possess activity on this pentose. The objective of this work was to clone Sp. arborariae genes that possibly encode sugar transporters and to express them in S. cerevisiae, characterizing the growth and fermentation capacity of the resulting strains in different sugars (maltose, glucose, xylose and sucrose). For this, two of the six Sp. arborariae genes that encode transporters that had not yet been characterized was amplified from the yeast genome. Then, both genes were inserted into constitutive expression plasmids. Each plasmid was inserted into S. cerevisiae hxt-null strains capable of metabolizing xylose, allowing the characterization of these transporters based on growth and fermentation experiments, determining the sugar consumption and ethanol and other metabolites production. The strains containing the genes SaXUT1 and tSaXUT1 were also tested for their simultaneous fermentation of sucrose and xylose. The strain containing the gene SaT10 showed growth and fermentation capacity of both glucose and xylose, indicating that this transporter is a non-selective glucose transporter. The lineage containing the gene SaT8 was able to ferment glucose although no growth in this carbon source was observed. In order to simulate 2G ethanol production conditions integrated with the conventional ethanol production process (1G), the S. cerevisiae strains developed besides the strains containing the SaXUT1 gene and truncated version (tSaXUT1) were tested in co-fermentation of xylose and sucrose. The results showed that the fermentative capacity of both glucose and xylose is impaired in both strains in the presence of fructose (from the extracellular hydrolysis of sucrose). Therefore, the internalization capacity of xylose of Sp. arborariae should be a reflection of the activity of some of its other sugar transporters.