Avaliação do efeito antitrombótico e anticoagulante de extratos brutos de algas marinhas e seus compostos isolados

Abstract

A hemostasia é um processo fisiológico que consiste em um equilíbrio entre proteínas pró-coagulantes e anticoagulantes. Distúrbios nos mecanismos hemostáticos podem ocasionar eventos tromboembólicos. A trombose é uma complicação de alta incidência, morbidade e mortalidade no Brasil e no mundo. Atualmente, diversos medicamentos são utilizados para a prevenção e o tratamento da trombose, porém ainda existem muitos efeitos adversos associados a sua utilização, o que limita o seu uso universal. Portanto, há a necessidade de novas terapias, com melhor custo-benefício e menos reações adversas. Nesse contexto, compostos de origem natural, com boa atividade sobre a hemostasia, podem representar um avanço tecnológico nas terapias anticoagulantes e antitrombóticas. Diante disso, este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito de extratos brutos de algas marinhas pardas e de seus compostos isolados sobre a agregação plaquetária e a coagulação sanguínea humana. A ação sobre a coagulação foi analisada pelo tempo de protrombina (TP) e tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPa). A atividade antiagregante foi avaliada por turbidimetria usando difosfato de adenosina (ADP), epinefrina, ácido araquidônico (AA) e colágeno como agonistas. Previamente a realização dos ensaios, o plasma rico ou pobre em plaquetas foi incubado a 37 °C com os extratos brutos ou os compostos isolados. Dos 27 extratos brutos avaliados, apenas um extrato de Dictyopteris jolyana prolongou significativamente o TTPa. No entanto, 15 extratos brutos inibiram significativamente da agregação plaquetária induzida por ADP e/ou epinefrina. A partir da triagem com os extratos, selecionaram-se cinco compostos isolados deles (DJ12, DJ13, DJ14, DJ17 e AP1) para verificar seu efeito sobre a hemostasia. Nenhum composto apresentou efeito anticoagulante, e quatro inibiram significativamente a agregação induzida por ADP e/ou epinefrina. O composto AP1, isolado da alga marinha parda Desmarestia menziesii J. Agardh, apresentou os melhores resultados e por isso foi selecionado para dar continuidade às investigações. Quando o ADP foi utilizado como agonista, a CI50 de AP1 foi de 201,8 ± 6,4 µM, frente à epinefrina foi de 239,7 ± 9,0 µM, ao AA foi de 207,5 ± 6,6 µM e ao colágeno foi de 156,9 ± 5,4 µM. A avaliação do perfil da curva de agregação sugeriu que AP1 interfere nos mecanismos relacionados com a resposta exógena da plaqueta, visto que inibiu parcialmente a primeira onda de agregação. Segundo o método de exclusão por azul de trypan, AP1 diminuiu em menos de 5% a viabilidade das plaquetas. A avaliação da expressão membranar de P-selectina e de GpIIb/IIIa ativa por citometria de fluxo demonstrou que AP1 inibiu a ativação plaquetária, uma vez que diminuiu em quase 100% a expressão de ambos marcadores. Ainda constatou-se que na concentração de 500 µM, AP1 era citotóxico para células mononucleadas sanguíneas. Contudo, AP1 apresentou-se fracamente hemolítico até a concentração de 720 µM. Segundo as regras de Lipinski e Veber, AP1 pode apresentar boa biodisponibilidade oral. Conclui-se que AP1 pode ser utilizado como protótipo para o desenvolvimento de um novo medicamento antitrombótico, uma vez que apresentou significativo efeito antiagregante, não afetou a viabilidade plaquetária, apresentou fraca atividade hemolítica e boa biodisponibilidade oral.

Abstract: Hemostasis is a physiological process consisting of a balance between procoagulant and anticoagulant proteins. Disturbances in hemostatic mechanisms can lead to thromboembolic events. Thrombosis is a complication of high incidence, morbidity and mortality in Brazil and in the world. Currently, several drugs are used for the prevention and treatment of thrombosis, but there are still many adverse effects associated with its utilization, which limits its universal use. Therefore, there is a need of new therapies, with better cost-benefit and less adverse reactions. In this context, compounds of natural origin, with good activity on hemostasis, may represent a technological advance in anticoagulant and antithrombotic therapies. The aim of this study was to evaluate the effect of crude extracts of brown marine algae and their isolated compounds on platelet aggregation and blood coagulation. The effect on coagulation was evaluated by prothrombin time (PT) and activated partial thromboplastin time (aPTT). The antiplatelet activity was evaluated by turbidimetry using adenosine diphosphate (ADP), epinephrine, arachidonic acid (AA) and collagen as agonists. Prior to the assays, rich or platelet-poor plasma was incubated at 37 °C with the crude extracts or the isolated compounds. Of the 27 crude extracts evaluated, only one extract of Dictyopteris jolyana significantly prolonged the TTPa. However, 15 crude extracts significantly inhibited platelet aggregation induced by ADP and/or epinephrine. From the screening with the crude extracts, five compounds isolated from them (DJ12, DJ13, DJ14, DJ17 and AP1) were selected to verify their effect on hemostasis. No compound had anticoagulant effect, and four significantly inhibited ADP and/or epinephrine-induced aggregation. The compound AP1, isolated from the brown algae Desmarestia menziesii J. Agardh, presented the best results and was therefore selected to continue the investigations. When ADP was used as an agonist, the IC50 of AP1 was 201.8 ± 6.4 µM, for epinephrine it was 239.7 ± 9.0 µM, for AA it was 207.5 ± 6.6 µM and for collagen it was 156.9 ± 5.4 µM. The evaluation of the profile of the aggregation curve suggested that AP1 interferes in the mechanisms related to the exogenous platelet response, since it partially inhibited aggregation?s first wave. According to the blue trypan exclusion method, AP1 decreased the platelet viability by less than 5%. Evaluation of P-selectin and active GpIIb/IIIa membrane expression by flow cytometry demonstrated that AP1 inhibited platelet activation, as it decreased the expression of both markers by almost 100%. It was further found that at the concentration of 500 µM, AP1 was cytotoxic to blood mononuclear cells. However, AP1 was poorly hemolytic up to the concentration of 720 µM. According to the rules of Lipinski and Veber, AP1 may have a good oral bioavailability. It is concluded that AP1 can be used as a prototype for the development of a new antithrombotic drug, since it presented a significant antiplatelet effect, did not affect platelet viability, and presented poor hemolytic activity and good oral bioavailability.