Efeitos da guanosina sobre a SUMOilação global de proteínas em modelos de neurodegeneração in vivo e in vitro e investigação do possível mecanismo de ação

Abstract

O processo de envelhecimento é fisiológico e afeta as funções tanto corporais quanto cognitivas, com concomitante redução das funções biológicas ao longo da vida de um indivíduo. A idade avançada é um dos fatores de risco para o surgimento de doenças neurodegenerativas como, por exemplo, a doença de Alzheimer (DA). Aliado a perda de memória observada nos pacientes, algumas alterações moleculares importantes em seus cérebros acompanham os sintomas da DA, como por exemplo, agregados do peptídeo beta amilóde (Aß). A SUMOilação é um exemplo de modificação pós traducional descoberta recentemente onde proteínas denominadas SUMO (do inglês, small ubiquitin-like modifier) são adicionadas a proteínas alvo promovendo dessa forma alteração da localização subcelular, modificando a interação com substratos, entre outros efeitos. A SUMOilação já foi demonstrada como neuroprotetora em diferentes modelos. Entre as moléculas endógenas associadas à neuroproteção, o nucleosídeo guanosina, apresenta um importante papel como neuromodulador e neuroprotetor em estudos sobre o envelhecimento e DA. Nesse sentido, o objetivo desta tese foi investigar se a guanosina poderia modular a SUMOilação in vivo e promover alterações comportamentais e também foi investigado se a guanosina poderia modular a SUMOilação in vitro aliado à investigação do possível mecanismo de ação. Para o estudo in vivo foram utilizados camundongos da linhagem C57BL/6 de 3 e 24 meses de idade. Os animais foram tratados com guanosina (8 mg/kg intraperitoneal) durante 14 dias, e nos últimos 8 dias submetidos aos testes comportamentais de campo aberto, realocação de objetos, labirinto em Y, borrifada de sacarose, suspensão pela cauda e labirinto aquático de Morris. O tratamento com guanosina nos animais jovens e idosos não alterou per se a atividade locomotora dos animais. Nos camundongos jovens o tratamento com guanosina per se promoveu uma melhora na memória espacial de curta duração no teste de realocação de objetos. Já nos camundongos idosos a guanosina promoveu a melhora na memória espacial de trabalho no teste de labirinto em Y. Com relação aos comportamentos tipo-depressivos não foram observados efeitos no teste de borrifada de sacarose quanto ao parâmetro de autolimpeza. No teste de suspensão pela cauda a guanosina aumentou o tempo de imobilidade dos animais jovens, sugerindo um efeito no coping estrategy desses animais. Para memória espacial de longa duração no labirinto aquático de Morris não houve diferenças. Com relação aos níveis de SUMOilação, houve um aumento significativo de SUMO1-ilação global no hipocampo dos animais jovens e idosos com o tratamento com guanosina. Com a abordagem in vitro, foi avaliado se a guanosina promovia modificações na SUMOilação global de proteínas. Para isso astrócitos e neurônios corticais de cultivo primário foram tratados com 1, 10, 100, 300 e 500 µM de guanosina nos tempos de 1, 6, 24 e 48 h. Os resultados obtidos na caracterização in vitro mostram que a guanosina aumentou significativamente a SUMO2/3-ilação global tanto em astrócitos quanto em neurônios no tempo de 1 h e nas concentrações acima de 10 µM, e que o aumento em 1 h não é devido ao seu metabólito guanina. Em astrócitos corticais foi verificado se a guanosina previne alterações na captação de glutamato, viabilidade celular, e reatividade astrocitária induzida pelo peptídeo Aß1-42. Dos parâmetros alterados pelo peptídeo Aß1-42 pode-se observar que a guanosina preveniu o fenótipo de reatividade astrocitária. Uma vez identificadas modificações na SUMOilação, os possíveis mecanismos moleculares foram investigados. O bloqueio da internalização da guanosina, com dipiridamol, não alterou o aumento na SUMO2/3-ilação global induzida por guanosina, demonstrando uma ação extracelular da guanosina. O bloqueio dos receptores de adenosina do tipo A1 com o antagonista DPCPX, aboliu o efeito da guanosina. O antagonista de receptores A2A de adenosina, ZM241385, aumentou a SUMOilação per se. Sugerindo que o receptor A2A também modula a SUMO2/3-ilação. Para verificar o efeito da guanosina na perda de viabilidade mitocondrial, neurônios corticais foram incubados com rotenona. No protocolo empregado a guanosina foi capaz de alterar a incorporação do corante mitocondrial mitotracker e aumentar o fator de fissão mitocondrial, contudo para compreender o que esses resultados sugerem, experimentos futuros precisam ser realizados. Esta tese é a primeira a demonstrar que uma molécula endógena, o nucleosídeo guanosina, modulou a SUMOilação.<br>

Abstract : The aging process is physiological and affects both body and cognitive functions, with a concomitant decrease in biological functions throughout the individual's life. Aging is one of the risk factors for the development of neurodegenerative diseases, such as Alzheimer's disease (AD). In addition to the memory loss observed in AD patients, some important molecular changes in their brains go along with the symptoms of AD, for example, beta-amyloid (Aß) peptide aggregates. SUMOylation is a posttranslational modification recently discovered where proteins called SUMO (small ubiquitin-like modifier) are target to proteins thereby promoting subcellular localization alteration, modifying the interaction with substrates among other functions. SUMOylation shown neuroprotective effects in different models. Among the endogenous molecules associated with neuroprotection, the nucleoside guanosine plays an important role as a neuromodulator and neuroprotectant in studies on aging and AD. In this sense, the objective of this thesis was to investigate if guanosine could modulate SUMOylation in vivo and promote behavioral changes, and wheater guanosine clould modulate SUMOylation in vitro with the investigation of the possible mechanisms of action. For the in vivo study, C57BL/6 male mice from 3 and 24 month-old were used. The animals received guanosine (8 mg / kg intraperitoneal) for 14 days, and in the last 8 days underwent behavioral tests: open field, object relocation, Y-maze, splash, tail suspension and Morris's water maze. Guanosine treatment in young and aged mice per se did not change the locomotor activity. In young mice guanosine treatment improved short-term spatial memory in object relocation test. In aged mice, guanosine improved working-term spatial memory in the Y-maze test. Regarding the depressive-like behaviors, no effects were observed on the splash test on the grooming behavior. In the tail suspension test, guanosine increased the immobility time of young animals, suggesting an effect on coping strategies of these animals. For long-term spatial memory in the Morris water maze no differences were found. Regarding SUMOylation levels, there was a significant increase of global SUMO1-ylation in the hippocampus of young and old mice with guanosine treatment. The in vitro approach, it was evaluated in a time / concentration dependent manner if guanosine promoted modifications in the global protein SUMOylation. For this objective, astrocytes and neurons from cortical primary cultures were treated with 1, 10, 100, 300 and 500 µM guanosine at times of 1, 6, 24 and 48 h. The results obtained in the in vitro characterization showed that guanosine significantly increased the global SUMO2/3-ylation in both astrocytes and neurons at 1 h and in concentrations above 10 µM. The increase observed in 1 h was not due to its metabolite guanine. In cortical astrocytes, it was verified if guanosine would promote changes in glutamate uptake, cell viability, astrocyte reactivity induced by the Aß1-42 peptide. From the parameters altered by the Aß1-42 peptide, guanosine prevented astrocytic reactivity phenotipe. Once SUMOylation modifications were identified, the possible molecular mechanisms were investigated. Blockade of guanosine internalization with dipyridamole did not alter guanosine-induced global SUMO2/3-ylation increase, demonstrating an extracellular action of guanosine. Blocking A1-adenosine receptors with the DPCPX antagonist, abolished the effect of guanosine. The A2A adenosine receptor antagonist, ZM241385, increased SUMOylation per se. Suggesting that the A2A receptor also modulates SUMO2/3-ylation. To verufy the guanosine effect in mithocondria viability, cortical neurons were incubated with rotenone. In the used protocol guanosine was able to alter the incorporation of mitochondrial dye mitotracker and increase mitochondrial fission factor. Althoug, further experiments are need to understand these results. This thesis is the first to demonstrate that an endogenous molecule, the nucleoside guanosine, modulated SUMOylation.