Lactonas sesquiterpênicas em espécies selecionadas de Vernonieae (Asteraceae): semissíntese e avaliação do potencial biológico (in vitro)

Abstract

As lactonas sesquiterpênicas (LS), composto característicos da família Asteraceae, destacam-se por suas propriedades anti-inflamatória, citotóxica e antiparasitária. Derivados semissintéticos de LS têm demonstrado propriedades farmacológicas melhoradas em relação ao produto de partida. Diante da necessidade do desenvolvimento de alternativas terapêuticas para o tratamento de neoplasias, leishmanioses e doença de Chagas, o objetivo deste trabalho foi isolar LS a partir de espécies selecionadas de Vernonieae (Asteraceae) para a modificação estrutural por semissíntese visando o desenvolvimento de derivados bioativos. A otimização do processo de extração por lavagem foliar em desenho experimental fatorial 4x4 a partir da espécie Vernonanthura tweedieana indicou como condições ideais de extração das LS a acetona como líquido extrator durante 10 minutos. Foi estabelecida uma estratégia de diferenciação por ESI-EM e EM/EM entre as LS do tipo hirsutinolídeo e glaucolídeo com base nas diferenças entre seus respectivos perfis de ionização, formação de adutos e fragmentação, sendo a primeira vez que o mecanismo de fragmentação para as LS do tipo glaucolídeo é detalhadamente discutido. A análise de desreplicação por CLUE-EM do extrato bruto de lavagem foliar (ELF) de V. tweedieana permitiu a identificação de 14 compostos (7 LS e 7 flavonoides). A partir dos ELF das espécies Lepidaploa chamissonis e Cyrtocymura scorpioides e da espécie Vernonanthura condensata, foram isoladas em grande quantidade por cromatografia de partição centrífuga (CPC) as LS glaucolídeo B e vernodalina, respectivamente. A extração por lavagem foliar mostrou-se um método seletivo para a extração de LS, enquanto que a técnica CPC foi uma ferramenta simples e eficiente para o isolamento desses constituintes com alto rendimento. Considerando que as condições ácido-base do meio extrativo/cromatográfico vêm sendo relacionadas à conversão estrutural e à formação de diferentes subtipos de LS, a estratégia baseada na ciclização transanular empregando catalizadores com variadas propriedades ácido-base, associada à condições reacionais complementares, mostrou-se uma abordagem eficiente para a produção de quatorze derivados semissintéticos de LS, sendo dez destes compostos relatados pela primeira vez. Na investigação in vitro da atividade biológica as LS piptocarfina A, diacetilpiptocarfol e vernodalina apresentaram moderada a fraca atividade leishmanicida (IC50=18,83 a 26,58 µM) frente à Leishmania amazonensis, e moderada atividade tripanocida (IC50=10,62 a 20,57 µM) frente à Trypanosoma cruzi, enquanto que as LS glaucolídeo A e glaucolídeo B não foram ativas para ambos os parasitas na forma amastigota intracelular. Na avaliação da atividade citotóxica em método de MTT, a LS piptocarfina A apresentou promissora atividade frente às células leucêmicas Nalm-6 e K-562 (CC50=2,8 µM e CC50=3,0 µM, respectivamente), enquanto que o glaucolídeo A mostrou moderada atividade frente às linhagens de células tumorais K-562, HL-60, REH, JURKAT, PC3, OVCAR, NCI-1299 e HOS (CC50=8,5 a 27,2 µM). As LS piptocarfina A, diacetilpiptocarfol e vernodalina (CC50=6,7 µM/IS=1,9, CC50=3,8 µM/IS=3,3, CC50=2,6 µM/IS=4,6, respectivamente), bem como dois derivados semissintéticos análogos de hirsutinolídeos e um análogo diepoxigermacranolídeo (CC50=11,2 µM/IS=2,5, CC50=5,0 µM/IS=3,0 e CC50=3,1 µM/IS=3,0, respectivamente) apresentaram ótima e seletiva atividade citotóxica frente à linhagem de células de melanoma humano (SK-MEL-28). Ainda, o glaucolídeo B apresentou promissora atividade anti-inflamatória nas doses de 1, 3 e 10 µM em células RAW 264.7 estimuladas por lipopolissacarídeos, cujo efeito inibitório sobre a produção de metabólitos NOx e da secreção de interleucina 6 foi similar à dexametasona (7 µM).

Abstract: The sesquiterpene lactones (SL), widespread in the Asteraceae family, are endowed with anti-inflammatory, cytotoxic and antiparasitic properties. Semisynthetic SL derivatives have shown improved pharmacological properties relative to the starting product. Because of high demand in developing therapeutic alternatives for the treatment of neoplasms and antiparasitic disease, the objective of this work was to isolate SL from selected Vernonieae (Asteraceae) species for structural modification by semisynthesis in order to develop bioactive derivatives. The optimization of the extraction process by leaves washing in experimental design 4x4 from the Vernonanthura tweedieana species turned to be an ideal condition for SL extraction using acetone as extractive solvent during 10 minutes. A strategy of differentiation between hirsutinolide and glaucolide-type SL by ESI-MS and MS/MS was established based on the differences observed in their respective MS spectra and related to their ionization, adduct formation and fragmentation profiles, wherein it is the first time that the fragmentation mechanism for glaucolide-type SL is discussed in detail. The UPLC-MS dereplication analysis of V. tweedieana leaves washing crude extract (LWE) allowed the identification of 14 compounds (7 SL and 7 flavonoids). Glaucolide B and vernodalin were respectively isolated in large quantities from the LWE of Lepidaploa chamissonis and Cyrtocymura scorpioides and from Vernonanthura condensata by centrifugation partition chromatography (CPC). Leaves washing process was a selective method for the SL extraction, whereas the CPC technique was a simple and efficient tool for the isolation of these constituents with high yield. Whereas the acid-base conditions of the extractive/chromatographic medium have been related to structural conversion and the formation of different SL subtypes, the strategy based on transannular cyclization employing catalysts with varying acid-base properties, associated with other reaction conditions, proved to be an efficient approach to produce fourteen semisynthetic SL derivatives, ten of which are reported for the first time. In the in vitro biological investigation, piptocarphin A, diacetylpiptocarphol and vernodalin presented from moderate to weak leishmanicidal activity (IC50=18.83 to 26.58 µM) against Leishmania amazonensis, and moderate trypanocidal activity (IC50=10.62 to 20.57 µM) against Trypanosoma cruzi, whereas glaucolide A and glaucolide B were not active against the intracellular amastigote form of both parasites. In the cytotoxicity activity evaluation by MTT method, piptocarphin A presented promising activity against Nalm-6 and K-562 leukemic cell lines (CC50=2.8 µM and CC50=3.0 µM, respectively) whereas the glaucolide A showed moderate activity against the cell lines K-562, HL-60, REH, JURKAT, PC3, OVCAR, NCI-1299 and HOS (CC50=8.5 to 27.2 µM). Piptocarphin A, diacetylpiptocarphol and vernodalin (CC50=6.7 µM/SI=1.9, CC50=3.8 µM/SI=3.3, CC50=2.6 µM/SI=4.6, respectively) as well as two semisynthetic hirsutinolide analogues and one diepoxygermacranolide analogue (CC50=11.2 µM/SI =2.5, CC50=5.0 µM/SI=3.0 and CC50=3.1 µM/SI=3,0, respectively) showed promissing and selective cytotoxic activity against the human melanoma cell line (SK-MEL-28). Furthermore, glaucolide B showed promising anti-inflammatory activity at 1, 3 and 10 µM doses in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 cells, whose inhibitory effect on NOx metabolite production and interleukin 6 secretion was similar to dexamethasone (7µM).