Desenvolvimento de método para determinação de aminoácidos em amostras de formulações farmacêuticas e alimentos por eletroforese capilar de zona

Abstract

O presente trabalho teve como objetivo propor um método rápido e simples para a determinação dos aminoácidos triptofano, fenilalanina, histidina, metionina e tirosina em amostras de diferentes matrizes utilizando a técnica de eletroforese capilar de zona. As amostras selecionadas foram de soluções parenterais injetáveis, medicamento composto por mistura de aminoácidos (indicado no tratamento dos distúrbios metabólicos hepáticos) e banana, sendo proposta nessa última, uma abordagem diferenciada das geralmente empregadas. O preparo de amostra para as soluções parenterais e medicamentos do estudo consistiu em diluição e homogeneização prévia à análise em equipamento de eletroforese capilar (CE - ?Capillary Electrophoresis?) acoplado a detector UV com arranjo de diodos. Já para amostras de banana o preparo de amostra iniciou com o processamento em mixer e hidrólises ácida (com ácido clorídrico) e básica (com hidróxido de lítio) durante 22h em estufa a 110°C, seguido de neutralização/precipitação com carbonato de prata e ácido fosfórico para as hidrólises ácida e básica, respectivamente, a fim de reduzir a força iônica antes da injeção no equipamento de CE. A seleção das condições experimentais de separação por CE foi realizada empregando o software Peakmaster®. O eletrólito aquoso selecionado foi composto por 70 mmol L-1 de butilamina e 20 mmol L-1 de ácido 3-N-morfolinopropanossulfônico, com pH final de aproximadamente 11, utilizando ácido p-tolueno sulfônico como padrão interno em todas as análises. O capilar empregado de sílica fundida, com revestimento externo de poliacrilato tem 50 µm de diâmetro interno, 48,5 cm de comprimento total e 40 cm de comprimento efetivo. A injeção foi realizada por pressão hidrodinâmica durante 7s e a tensão de separação +30 kV. O tempo total para a determinação dos cinco aminoácidos de interesse foi de aproximadamente 5,5 min. O método foi validado seguindo as recomendações do ICH (International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use), ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) e AOAC (Association of Official Analytical Chemists). O método se mostrou linear na faixa estudada, de 5 mg L-1 a 100 mg L-1, com r2 > 0,99 para todos analitos. A aplicação do método nas amostras de solução parenteral foi satisfatória para triptofano, fenilalanina e metionina. Para análise de medicamentos, foi possível quantificar uma das três amostras investigadas. O método proposto mostrou que a análise de cinco aminoácidos por eletroforese capilar pode se tornar uma alternativa a ser implementada em controle de qualidade desses produtos. O preparo de amostras a ser utilizado em banana se mostrou inovador se comparado a outras formas frequentemente utilizadas no preparo dessas matrizes, porém ainda necessita de maiores estudos e aprimoramento, pois não foi conclusivo. Ao comparar o método proposto a outros trabalhos relatados na literatura que envolvem determinação de aminoácidos, nota-se considerável a redução de tempo e simplicidade dos procedimentos propostos.

Abstract: The aim of this study was to propose a fast and simple method for the determination of the amino acids tryptophan, phenylalanine, histidine, methionine and tyrosine in samples of different matrices using a capillary zone electrophoresis technique. The selected samples were injectable parenteral solutions, a drug composed of a mixture of amino acids (indicated in the treatment of hepatic metabolic disorders) and banana, being proposed in this last approach differentiated from those generally employed. The sample preparation for parenteral solutions and drugs consisted of dilution and homogenization prior to analysis in capillary electrophoresis (CE) coupled to UV with diode-array detector. The sample preparation for banana begins with the processing in mixer and acid hydrolysis(with hydrochloric acid) and basic hydrolysis (with lithium hydroxide) for 22 h in an oven at 110 ° C, followed by neutralization/precipitation with silver carbonate and phosphoric acid for acid and basic hydrolysis, respectively, in order to reduce the ionic strength before injection into CE equipment. The selection of experimental conditions for CE separation was performed using Peakmaster® software. The selected aqueous electrolyte was composed of butylamine70 mmol L-1 and 3-N-morpholinopropanesulfonic acid 20mmol L-1, with final pH of approximately 11 using p-toluene sulfonic acid as internal standard in all analyzes. The fused silica capillary with external polyacrylate coating is 50 µm in internal diameter, 48.5 cm in total length and 40 cm in effective length. The injection was performed by hydrodynamic pressure for 7s and the separation voltage +30 kV. The total time for the determination of these five amino acids was about 5,5 min. The method was validated following the recommendations of ICH (International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use), ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) and AOAC (Association of Official Analytical Chemists). The method was linear in the studied range, from 5 mg L-1 to 100 mg L-1, with r2> 0.99 for all analytes. The application in the parenteral solution was satisfactory for tryptophan, phenylalanine and methionine. Analysis of drugs, it was possible to quantify one of the three samples investigated. The method showed that the analysis of five amino acids by capillary electrophoresis can become an alternative to be implemented in quality control of these products. The sample preparation to be used in food has shown to be innovative compared to other forms frequently used in the preparation of these matrices, but still needs further studies and improvement, since it was not conclusive. When comparing the proposed method to other studies reported in the literature involving amino acid determination, it was noticed the reduction of time and simplicity of the proposed procedures.