Produção de metabólitos bioativos pelo fungo Ganoderma lipsiense cultivado em arroz vermelho

Abstract

Os fungos basidiomicetos são reconhecidos por produzirem distintos compostos de importância biológica e terapêutica. Este trabalho teve como objetivo identificar compostos bioativos com propriedades biológicas produzidos pelo fungo Ganoderma lipsiense cultivado em arroz vermelho. O trabalho foi realizado em quatro etapas: na primeira etapa Ganoderma lucidum, Ganoderma applanatum e Ganoderma lipsiense foram cultivados em arroz vermelho por fermentação em estado sólido (FES) a fim de selecionar um fungo com potencial de produção de cumarinas. Todos os fungos apresentaram uma produção indicativa destas moléculas por análises qualitativas e valores similares quanto ao teor nos ensaios quantitativos espectrofotométricos. O fungo G. lipsiense mostrou melhor crescimento morfológico dentre os fungos testados, além de menor volume de publicações descritas na literatura, sendo este selecionado para estudos cinéticos subsequentes. Ganoderma lipsiense foi cultivado em arroz vermelho por 63 dias com extrações a cada 7 dias para identificação dos compostos fenólicos e avaliação da atividade antibacteriana contra Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus. Foram identificados no extrato os ácidos cafeico, siríngico, salicílico, ferúlico, p-cumárico e vanilina por cromatografia líquida de alta eficiência / espectrometria de massa por ionização por eletrovaporização (HPLC-ESI-MS/MS). Os ácidos cafeico e siríngico, assim como a vanilina foram produzidos por G. lipsiense, sendo quantificados por cromatografia líquida de alta performance com detecção de rede de diodo (HPLC) maiores concentrações de vanilina e ácido cafeico no extrato do 49º dia. O extrato se mostrou ativo somente para P. aeruginosa com melhores atividades em 63 dias. A partir de um novo cultivo de G. lipsiense em arroz vermelho por FES, na segunda etapa, foi possível identificar biocompostos produzidos pelo fungo presentes nas frações apolares do extrato. O esteroide ergosta-6,22-dieno-3ß,5a,8a-triol foi identificado a partir de análises de infravermelho (FTIR) e ressonância magnética nuclear de carbono e hidrogênio (RMN 1H e 13C), no qual mostrou significativa atividade antiparasitária contra Giardia duodenalis na concentração de 500 µg·mL-1. Além do esteroide, foram identificados 18 ácidos graxos nas frações purificadas com hexano e diclorometano, dentre eles os ácidos oleico, linoleico, palmítico, tetradecanóico e pentadecanóico. O extrato bruto e as frações purificadas tiveram atividade antibacteriana contra P. aeruginosa e S. aureus nas concentrações de 500 µg·mL-1 e atividade antiparasitária contra G. duodenalis na concentração de 100 µg·mL-1. A partir da terceira etapa, o fungo foi cultivado por fermentação submersa (FS). Na etapa três, foi avaliada a atividade antiparasitária contra G. duodenalis além da identificação dos compostos produzidos no micélio de G. lipsiense cultivado em meio sintético. Foram identificados esteroides, ácidos graxos e compostos como sesquiterpenos, aldeídos e álcoois, com destaque para os esteroides ergosta-5,8,22-trien-3ß-ol, ergosta-5,8(14)-dien-3-ol, 7,22-ergostadienol, ergosta-7,22-dien-3-ol (3ß,22E), ergosta-7,22-dien-3-ol (3ß, 5a, 22E), ergosterol, 7,22-ergostadienona e ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-ona e do sesquiterpeno ar-turmerona. Elevadas atividades antiparasitárias foram observadas, especialmente na fração hexano. A quarta etapa deste trabalho avaliou o potencial inibitório da enzima a-glicosidase pelo extrato bruto da primeira etapa, do extrato micelial da terceira etapa e do extrato micelial do fungo cultivado em meio a base de arroz vermelho. Os extratos miceliais apresentaram melhores atividades inibidoras da enzima a-glicosidase, com inibições > 96%. Os ajustes dos dados experimentais por modelos matemáticos não-lineares indicaram uma inibição competitiva ocasionada pelo extrato micelial cultivado em arroz vermelho, enquanto o extrato micelial cultivado em meio sintético tem características de inibição incompetitiva. Assim, constatou-se que o fungo G. lipsiense testado nesse trabalho possui habilidades para produzir biocompostos com atividades antibacterianas, antiparasitárias, além de inibidores da enzima a-glicosidase, dependendo do tipo de substrato utilizado e da forma de cultivo empregada.

Abstract : Basidiomycete fungi are recognized for producing several compounds with important biological and therapeutic properties. This work aimed to identify bioactive compounds with biological properties produced by the Ganoderma lipsiense fungus cultivated in red rice. Four stages were carried out in this work: in the first stage Ganoderma lucidum, Ganoderma applanatum and Ganoderma lipsiense were cultivated in red rice by solid-state fermentation (SSF) in order to select a fungus with potential for coumarins production. All fungi presented an indicative production of these molecules by qualitative analyzes and similar values for the content in the quantitative spectrophotometric assays. The G. lipsiense fungus showed better morphological growth among the fungi tested, as well as lower volume of publications described in the literature, being selected for subsequent kinetic studies. Ganoderma lipsiense was grown in red rice for 63 days with extractions every 7 days to identify the phenolic compounds and evaluate of the antibacterial activity against Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Caffeic acid, syringic acid, salicylic acid, ferulic acid, p-coumaric acid and vanillin were identified in the extract by high-performance liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-MS / MS). Caffeic and syringic acids as well as vanillin were produced by G. lipsiense, and higher concentrations of vanillin and caffeic acid were measured by high-performance liquid chromatography with diode-array detection (HPLC) in 49 days. The extract was only effective against P. aeruginosa with higher activities in 63 days. G. lipsiense was grown again on red rice by SSF, in the second stage, and then was possible to identify biocomposites produced by the fungus present in the non-polar fractions of the extract. The steroid ergosta-6,22-dien-3ß,5a,8a-triol was identified from infrared (FTIR) and nuclear magnetic resonance of carbon and hydrogen (1H and 13C NMR) from the purified extract, and it which it showed significant antiparasitic activity against Giardia duodenalis at the 500 µg·mL-1 concentration. In addition to the steroid, 18 fatty acids were identified in the fractions purified with hexane and dichloromethane, among them oleic, linoleic, palmitic, tetradecanoic and pentadecanoic acids. The crude extract and the purified fractions had antibacterial activity against P. aeruginosa and S. aureus at concentrations of 500 µg·mL-1 and antiparasitic activity against G. duodenalis at the concentration of 100 µg·mL-1. Third and fourth stages, the fungus was cultivated by submerged fermentation (SF). The third step consisted in the antiparasitic activity evaluation against G. duodenalis and identification of biocompounds produced in the mycelium of the G. lipsiense grown in synthetic medium. At this stage, steroids, fatty acids and compounds such as sesquiterpenes, aldehydes and alcohols were identified, with highlights for ergosta-5,8,22-trien-3ß-ol, ergosta-5,8(14)-dien-3-ol, 7,22-ergostadienol, ergosta-7,22-dien-3-ol (3ß,22E), ergosta-7,22-dien-3-ol (3ß, 5a, 22E), ergosterol, 7,22-ergostadienone and ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one, in addition to the sesquiterpene Ar-turmerone. High antiparasitic activities were observed for mycelial extracts of G. lipsiense, especially in the hexane fraction. The fourth step of this work evaluated the inhibitory potential of the a-glycosidase enzyme for the G. lipsiense crude extract of the first stage, the third stage mycelial extract and the mycelial extract of the fungus cultivated in red rice-based medium. The mycelial extracts presented higher inhibitory activities of the a-glycosidase enzyme, with > 96 percent of inhibitions. The adjustments of the experimental data by nonlinear mathematical models indicated a competitive inhibition caused by the mycelial extract growth in red rice, while the mycelial extract growth in synthetic medium has uncompetitive inhibition characteristics. Thus, the results showed that G. lipsiense fungus evaluated in this work has the ability to produce distinct biocompounds with antibacterial, antiparasitic activity, as well as a-glycosidase inhibitor, depending on the type of substrate used and the culture form evaluated.