Validação da imunofenotipagem por citometria de fluxo para a investigação de marcadores de diagnóstico e de prognóstico para o câncer de mama

Abstract

O câncer de mama é o segundo tipo de câncer que mais acomete a população mundial, o que causa um forte impacto financeiro sobre os sistemas de saúde. Atualmente, o diagnóstico do câncer de mama é realizado pela análise morfológica e imuno-histoquímica do tecido removido. Todavia, essa metodologia apresenta algumas limitações como: a morosidade, o limite do número de marcadores fenotípicos a serem avaliados simultaneamente, e o número limitado de células analisadas por amostra. Portanto, vê-se a necessidade do desenvolvimento de metodologias capazes de auxiliar aquelas já utilizadas, o que possibilita a detecção rápida e segura das células tumorais. Assim, o objetivo deste trabalho foi validar a imunofenotipagem por citometria de fluxo para a investigação de marcadores de diagnóstico e de prognóstico para o câncer de mama e investigar os subtipos de linfócitos infiltrados no tumor e sua relação com o desenvolvimento tumoral. Para tanto, 52 amostras de tumores de mama foram seccionadas e maceradas juntamente com tampão salina-fosfato. Posteriormente, a suspensão celular obtida foi marcada com anticorpos contra receptores de estradiol (RE), progesterona (RP), HER2, Ki67, CD3, CD4, CD8 e CD45 e analisadas por citometria de fluxo. Para determinar o padrão de expressão das amostras, as células tumorais marcadas foram comparadas com os linfócitos, que não expressam os marcadores de importância para o câncer de mama. Todos os resultados foram comparados com a imuno-histoquímica (padrão ouro) em relação a sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (VPP) e valor preditivo negativo (VPN), exceto o Ki67, onde foi realizada a comparação do viés entre as metodologias e a correlação entre os subtipos de linfócitos e características tumorais. Os resultados obtidos comparando a citometria de fluxo com a imuno-histoquímica (padrão ouro) para cada marcador foram: análise de RE (sensibilidade: 75%, especificidade: 90%, VPP: 96,7%, VPN: 47,4%); análise de RP (sensibilidade: 72%, especificidade: 70%, VPP: 79,3%, VPN: 60,8%); análise de HER2 (sensibilidade: 80%, especificidade: 90,2%, VPP: 66,7%, VPN: 94,9%). A análise do marcador de proliferação celular Ki67 por citometria de fluxo mostrou-se equivalente à imuno-histoquímica, com a vantagem de não apresentar viés observacional. Não foram observadas correlações entre o perfil da população de linfócitos intratumorais com o subtipo molecular ou com o grau histológico do tumor. Os resultados do presente estudo evidenciam a capacidade da citometria de fluxo para detectar com segurança e agilidade os marcadores do câncer de mama utilizados na prática clínica, aliada à possibilidade de investigar o fenótipo das células linfoides infiltradas no tecido tumoral. Acredita-se que a utilização da citometria de fluxo, em conjunto com a análise morfológica e a imunohistoquímica podem sobrepor as limitações individuais de cada uma das metodologias e proporcionar resultados fidedignos de maneira mais rápida e eficiente, o que resultará em diagnósticos mais rápidos e prognósticos mais acurados, beneficiando diretamente os pacientes.

Abstract: Breast cancer is the second most common cancer worldwide, which causes an important financial impact over the healthcare systems. Nowadays, molecular diagnosis of breast cancer is performed by morphological analysis and immunohistochemistry of the removed tissue. However, this methodology has some limitations: it slowness, few markers that can be evaluated simultaneously and only a limited number of cells is analyzed per sample. Therefore, there is a demand for development of new analytical methods able to support the currently used, making detection of cancer cells faster and safer. So, the aim of this study is to validate flow cytometry immunophenotyping to investigate diagnostic and prognostic markers of breast cancer and investigate the subtypes of tumor infiltrating lymphocytes and their relationship with tumor development. Therefore, tumor samples from surgical specimens of patients were first sliced and then macerated together with phosphatebuffered saline. Then, 52 samples were filtered and the single cell suspension obtained was labeled with antibodies against estradiol receptors (ER), progesterone receptors (PR), HER2 receptors, Ki67, CD3, CD4, CD8 and CD45 and analyzed by flow cytometry. In order to determine the expression patterns of the samples, labeled BC cells were compared with lymphocytes, which do not express the receptors of interest. All the results were compared with reference methods in terms of sensitivity, specificity, positive predictive value (PPV) and negative predictive value (NPV), except Ki67, which had the methodological bias compared and the correlations between intratumoral lymphocytes profile and the breast cancer characteristics. The results obtained comparing flow cytometry with reference method for each marker were: ER detection (sensitivity: 75%; specificity: 90%; PPV: 96,7%; NPV: 47,4%); PR detection (sensitivity: 72%; specificity: 70%; PPV: 79,3%; NPV: 60,8%); HER2 detection (sensitivity: 80%; specificity: 90,2%; PPV: 66,7%; NPV: 94,9%). The analysis of proliferation marker Ki67 by flow cytometry proved to be equivalent to imunohistochemistry, with the advantage of being free from observational bias. No correlation was observed between the intratumoral lymphocyte population profile and the molecular subtype or tumor grade. The results obtained so far show the capacity of flow cytometry to detect and differentiate with agility and safety breast cancer markers used in clinical practice, together with the possibility of investigate the phenotype of tumor infiltrated lymphocytes. We believe that flow cytometry, together with morphological analysis and immunohistochemistry can overcome individual limitations of each methodology and provide reliable results on a faster and efficient manner, resulting in faster diagnosis and more accurate prognosis, directly benefiting patients.