Mecanismos envolvidos na inibição da quimiotaxia de neutrófilos humanos pela alfa-1-glicoproteína ácida

Abstract

A migração dos neutrófilos é fundamental para uma resposta inflamatória eficaz, no entanto quando desregulada pode levar a uma infiltração excessiva dessas células nos tecidos resultando em dano. A proteína de fase aguda alfa-1 glicoproteína ácida (AGP) atua como um regulador da migração dos neutrófilos inibindo diferentes etapas nesse processo como o rolamento e adesão in vivo e quimiotaxia in vitro. No entanto, os mecanismos celulares pelo qual a AGP inibe a migração dos neutrófilos para os sítios inflamatórios ainda não foram completamente elucidados. Uma vez que muitas das atividades da AGP estão relacionadas a sua porção de carboidratos e a perda dos resíduos de ácido siálico compromete sua capacidade de modulação do sistema imune, nós levantamos a hipótese de que a AGP inibe a quimiotaxia de neutrófilos por meio da ativação de receptores Siglec (sialic-acid-binding immunoglobulin-like lectins)-5 e/ou de Siglec-9. Siglecs são uma família de receptores inibitórios expressos em neutrófilos que se ligam a ácido siálico, e quando ativados regulam negativamente a resposta inflamatória. Nesse contexto, o impacto da glicosilação da AGP em neutrófilos humanos ativados pelo fMLP foi avaliado após 40 minutos de incubação das células com diferentes concentrações da proteína, variando de 0,1 a 1 mg/ml. Para avaliar se os resíduos de ácido siálico da AGP influenciam no efeito inibitório, a AGP desialilada (tratada com neuraminidase, enzima que cliva o ácido siálico na sua conformação a-2,3 - a-2,6- ou a-2,8) também foi utilizada. Nossos resultados demonstraram que, in vitro, a AGP inibe a quimiotaxia e a polimerização de actina de neutrófilos induzida por fMLP, por um mecanismo dependente de seus resíduos de ácido siálico. Além disso, a inibição da polimerização de actina em resposta ao fMLP foi suprimida quando os neutrófilos foram pré-incubados com anticorpos neutralizantes anti-Siglec-5, mas não com anti-Siglec-9. Entretanto, a AGP não inibe o processo de fagocitose induzido por Escherichia coli. Os efeitos da AGP sobre a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e ativação de integrinas b2 também foram investigadas. A produção de ROS pelos neutrófilos induzida pelo fMLP ou PMA foi inibida pela AGP sialilada e em concentrações mais elevadas também pela sua variante sem o ácido siálico. Ainda, o tratamento dessas células com AGP, previamente ao estímulo com fMLP, inibiu a mudança conformacional de ativação das integrinas b2 pela via inside-out de ativação. Juntos, esses resultados demonstram que a AGP inibe a quimiotaxia de neutrófilos mediada por fMLP, ao prejudicar a polimerização de actina e ativação das integrinas. Além disso, o efeito supressor da AGP na polimerização de actina ocorre por meio da interação entre os resíduos de ácido siálico da proteína e o receptor Siglec- 5 dos neutrófilos.

Abstract: Neutrophil recruitment has a central role in host response and resolution of inflammation, but if uncontrolled it can lead to severe tissue damage. Due to its harmful effects, neutrophils migration must be tightly regulated to prevent an exacerbated infiltration. The acute phase protein Alpha-1-acid glycoprotein (AGP) has been shown to inhibit some steps of the neutrophil migration process, such as rolling and adhesion in vivo, and chemotaxis in vitro. However, the specific mechanism by which AGP inhibits the neutrophil migration to the focus of infection has not been fully elucidated yet. Since AGP activity is related to its carbohydrate portion, and the loss of its sialic acid residues implicates its capacity to modulate the immune system, we hypothesized that Siglec (sialic-acid-binding immunoglobulin-like lectins)-5 or ?9 activation by AGP inhibits the mechanisms related to human neutrophil chemotaxis. Siglecs are a family of inhibitory receptors expressed on neutrophils that bind to sialic acid to down regulate the inflammatory response. In this context, the role of AGP sialylation on human neutrophils activated by fMLP was evaluated after 40 minutes of incubation with protein ranging from 0.1 to 1 mg/ml. In order to evaluate whether AGP sialic acid residues influence on the inhibitory effect, a desialilated AGP (dAGP) (AGP treated with neuraminidase that cleaves sialic acid in a-2,3 - a-2,6- or a-2,8 conformation) was also used. Our results showed that AGP inhibits in vitro neutrophil chemotaxis and actin polymerization by a sialic acid-dependent mechanism. In addition, the inhibition of actin polymerization by AGP in response to fMLP was abrogated when neutrophils were incubated with an anti-Siglec-5, but not by an anti-Siglec-9, neutralizing antibody prior to AGP treatment. On the other hand, the neutrophil E.coli phagocytosis was not altered by the suppressive effect of AGP in actin polymerization. Siglec receptors are also involved in ROS production and integrin activation, therefore the effects of AGP on these neutrophil responses were also investigated. ROS production was shown to be inhibited by AGP and by its variant without sialic acid. Neutrophils treatment with AGP prior to fMLP stimulation also impaired the integrins activation conformational change and inhibited their inside-out pathway of activation. Taken together, our results demonstrated that AGP inhibits fMLP-mediated neutrophil chemotaxis by impairing actin polymerization and integrin activation. Moreover, the suppressive effect of AGP on actin polymerization relays on the interaction between the protein sialic acid residues and the neutrophil receptor Siglec-5.