Estabelecimento e comparação de modelos preditivos convencionais e moleculares para descrever o crescimento de bactérias deteriorantes de produtos cárneos

Abstract

O objetivo geral desta tese de doutorado foi comparar os métodos de contagem em placas (CP) e quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) para enumeração de bactérias ácido-lácticas (BAL) deteriorantes em cultura pura e mista e estabelecer modelos preditivos moleculares e convencionais para descrever as cinéticas de crescimento. Para isso, foram construídas curvaspadrão para Weissella viridescens e Lactobacillus plantarum e as curvas de crescimentos dessas espécies foram quantificadas por CP e por SYBR® Green qPCR em cultura pura e mista a 30 °C. No entanto, os valores obtidos por SYBR® Green qPCR foram superestimados quando comparados com o método de CP. Para diminuir esse viés, novas curvas-padrão foram construídas baseadas no crescimento de um coquetel de W. viridescens cultivadas a 4, 8, 14 e 30 °C de cultivo, utilizando o primeiro ponto da fase estacionária de crescimento para a construção dessas curvas. Com isso, os métodos de CP e de SYBR® Green qPCR foram adequados para quantificar a cinética do crescimento de crescimento de W. viridescens em cultura pura em todas as temperaturas constantes, demonstrando uma boa correlação e concordância. Ainda, o método de SYBR® Green qPCR foi específico para quantificar a cultura mista de W. viridescens e Leuconostoc mesenteroides a 8 °C, com a diferenciação das cinéticas de crescimento. Diante disso, os dados de crescimento dessas espécies em cultura pura e mista foram utilizados para a obtenção dos parâmetros de crescimento por meio de ajustes de modelos preditivos. Os resultados provaram que os modelos de Baranyi e Roberts (BAR), Gompertz modificado e Logístico modificado foram adequados para descrever as curvas de crescimento de W. viridescens em cultura pura e da cultura mista dessa espécie com L. mesenteroides a 8 °C. No entanto, para verificar a eficiência dos métodos de CP e TaqMan? qPCR combinados com uma abordagem de microbiologia preditiva, curvas-padrão para a quantificação de L. mesenteroides e de W. viridescens em amostras de morcilla embalada a vácuo (MB) e armazenadas a 5, 8, 13 e 18 °C foram utilizadas. Ambos os métodos foram comparados, e uma análise de regressão linear demonstrou uma correlação linear altamente e estatisticamente significativa. Posteriormente, o modelo de BAR foi ajustado aos dados das curvas de crescimento para estimar os parâmetros cinéticos e modelos secundários foram usados para descrever a dependência desses parâmetros com a temperatura. Os resultados comprovaram que os modelos, primário e secundário, foram adequados para descrever as curvas de crescimento para ambas as bactérias e os dois métodos em MB. Em conclusão, os resultados de todos os experimentos comprovaram que os métodos de qPCR (baseados em SYBR® Green e TaqMan?) e de CP podem ser usados para descrever a cinética microbiana de crescimento de BAL em cultura pura e mista em diferentes condições isotérmicas. Além disso, os modelos primário e secundário podem ser usados para estabelecer modelos preditivos convencionais e moleculares para predizer o crescimento de BAL em meio de cultivo (cultura pura e mista) e em produtos cárneos cozidos e embalados a vácuo com características semelhantes às da morcilla.

Abstract: This doctoral thesis aimed to compare plate count (PC) and quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) methods for enumeration of spoilage lactic acid bacteria (LAB) in pure and mixed culture and to establish molecular and conventional predictive models to describe growth kinetics. For this, standard curves were constructed for W. viridescens and L. plantarum and growth curves of these species were quantified by PC and SYBR® Green qPCR in the pure and mixed culture at 30 °C. However, the values obtained by SYBR® Green qPCR were overestimated when compared with the PC method. To reduce this bias, new standard curves were constructed based on the growth of a W. viridescens cocktail at 4, 8, 14 and 30 °C, using the first point of the stationary growth phase to construct these curves. Thus, the PC and SYBR® Green qPCR methods were adequate to quantify growth kinetics of W. viridescens in the pure culture at all isothermal temperatures, demonstrating a good correlation and agreement. Furthermore, the SYBR® Green qPCR method was specific for quantifying the mixed culture of W. viridescens and Leuconostoc mesenteroides at 8 °C, with differentiation of growth kinetics. Therefore, growth data of these species in pure and mixed culture were used to obtain growth parameters by fitting predictive models. The results proved that the Baranyi and Roberts (BAR), modified Gompertz and modified Logistic models were adequate to describe the growth curves of W. viridescens in pure culture and mixed culture of this species with L. mesenteroides at 8 °C. However, to verify the efficiency of the PC and TaqMan? qPCR methods combined with a predictive microbiology approach, standard curves for the quantification of L. mesenteroides and W. viridescens in vacuum-packaged morcilla (VM) samples stored at 5, 8, 13 and 18 °C were used. Both methods were compared, and a linear regression analysis demonstrated a statistically significant linear correlation. Subsequently, the BAR model was fitted to the growth curve data to estimate the kinetic parameters and secondary models were used to stablish the dependence of these parameters under isothermal conditions. The results proved that the primary and secondary models were adequate for describing the growth curves for both bacteria and both methods in VM. In conclusion, the results of all experiments proved that qPCR (based on SYBR® Green and TaqMan?) and PC methods could be used to construct growth kinetics microbial of LAB in pure and mixed culture under different isothermal conditions. Besides, the primary and secondary models could be used to establish conventional and molecular predictive models to predict LAB growth in culture medium (pure and mixed culture) and cooked vacuum-packaged meat products with characteristics similar to morcilla.