Predictive modelling for the growth of Bacillus cereus in Reconstituted Infant Gormula and culture medium at population and single cell levels

Abstract

Abstract : Bacillus cereus is a spore-forming and a toxin-producing bacteria; it is therefore an emerging concern for the food industry. The objective of this study was to investigate the growth of B. cereus and provide appropriate predictive models taking into account the medium, temperature, strains, and thermal stress. To do so, a quantitative methodology was developed to follow B. cereus development after a heat stress in two growth media (Reconstituted Infant Formulae (RIF) and culture medium (BHI)) at population and individual cell level by means of direct (viable counts) and indirect (turbidity) measurements. In viable counts experiments, growth rates were higher in BHI when compared to RIF, and a strain-dependent bias factor could be estimated. The heat stress caused a 2 log (CFU/mL) reduction on average, but did not significantly affect the subsequent growth of survival cells. As for cardinal values estimations, the growth boundaries of three B. cereus strains (B596, B594 and B626) from the Nestlé Pathogen Culture Collection were successfully determined in terms of temperature, pH, and aw. These were compared to other two strains from emetic group, analysing intra-group and pair-wise differences. B594 strain differed more from the all the others strains in terms of their cardinal parameters and strains B596 and B626 are equal in all parameters. The predictions of B. cereus growth in RIF made with the cardinal parameter values determined by turbidity in culture medium were good, especially when using bias factor to estimate optimal growth rate in RIF. Confronted with literature data from different sources and from a variety of dairy products, the proposed general secondary model for emetic B. cereus showed reasonably good performance with more than 85% of the collected growth rates within the confidence boundaries. Additionally, no significant difference on the probability of growth of heated and unheated individual cells for all investigated temperatures could be inferred and also no significant difference on the average individual cells lag time, denying the initial hypothesis that says heated cells would need an extra adaptation period in a new environment. This result is aligned with the one at population level. Recommendations on target value of average number of cells per wells were given in order to optimize single-cell probability of growth experiments using turbidity measurements. The findings constitute an important insight about different features of B. cereus behaviour that can be applied by the food industry to improve processing and/or to give guidance on decisions based on Quantitative Risk Assessment.<br>

Bacillus cereus é uma bactéria formadora de esporos e produtora de toxinas, sendo, portanto, uma preocupação emergente para a indústria de alimentos. O objetivo deste estudo foi investigar o crescimento de B. cereus e fornecer modelos preditivos apropriados, levando em consideração o meio de crescimento, a temperatura, as cepas e o estresse térmico. Para isso, uma metodologia quantitativa foi desenvolvida para acompanhar o desenvolvimento de B. cereus após determinado estresse térmico em dois meios de crescimento (Fórmula Infantil Reconstituída (RIF) e meio de cultura (BHI)) a nivel populational e de célula individual por meio de contagem direta (contagem de células viáveis em placas) e indireta (turbidez). Nos experimentos de contagem direta, as velocidades de crescimento foram maiores em BHI quando comparado ao RIF, e um fator bias pôde ser estimado para cada cepa investigada. O estresse térmico causou uma redução de 2 log (UFC/mL) em média, mas não afetou significativamente o crescimento subseqüente das células sobreviventes. Quanto às estimativas de valores cardinais, os limites de crescimento de três cepas de B. cereus (B596, B594 e B626) da Coleção de Culturas de Patógenos da Nestlé foram determinados com sucesso em termos de temperatura, pH e aw. Estes foram comparados com outras duas cepas pertencentes ao grupo emético, analisando as diferenças entre o grupo e par a par. A cepa B594 diferiu mais de todas as outras em termos dos seus parâmetros cardinais e as cepas B596 e B626 são iguais em todos os parâmetros. As predições de crescimento de B. cereus em RIF feitas utilizando os parâmetros cardinais determinados em meio de cultura foram boas, especialmente quando se utiliza o fator bias para estimar a velocidade de crescimento ótima em RIF. Confrontado com dados de literatura de diferentes fontes e de uma variedade de produtos lácteos, o modelo secundário proposto para o grupo emético de B. cereus apresentou um desempenho razoavelmente bom, com mais de 85% das taxas de crescimento coletadas dentro dos limites de confiança do modelo. Além disso, nenhuma diferença significativa na probabilidade de crescimento de células individuais estressadas e não estressadas para todas as temperaturas investigadas foi inferida e também nenhuma diferença significativa na duração da fase lag das células individuais, negando a hipótese inicial de que as células estressadas precisariam de um período de adaptação extra quando inoculadas em um novo ambiente. Este resultado está alinhado com o que foi observado a nível populacional. Recomendações sobre o número ideal de células por poço foram dadas a fim de otimizar experimentos de medida indireta (turbidez) que objetivem estimar a probabilidade de crescimento de células individuais. As descobertas constituem uma compreensão importante sobre as diferentes características do comportamento de B. cereus que podem ser aplicadas pela indústria de alimentos para melhorar o processamento e/ou dar orientações sobre decisões baseadas na Avaliação Quantitativa de Riscos.