Um modelo in vitro para identificação de propriedades emergentes da transformação genética de plantas

Abstract

Esta tese elabora um modelo baseado em culturas de células, tecidos e órgãos vegetais como alternativa para detecção de propriedades emergentes em plantas geneticamente modificadas (GM). A avaliação de propriedades emergentes em culturas in vitro apresenta vantagens potenciais em comparação a plantas ex vitro, quais sejam: i) utilização de um modelo biológico de menor complexidade que o sistema real (i.e. culturas de um ou poucos tipos de células, tecidos ou órgãos vegetais vs. a planta inteira, com múltiplos órgãos, tecidos e células em interação); ii) alto controle ambiental, viabilizando comparações fidedignas entre plantas transgênicas e suas contrapartes convencionais; iii) alta resolução de propriedades emergentes em processos ontogenéticos e morfogenéticos; iv) altas taxas de crescimento/proliferação; e v) aplicabilidade para experimentação. Um modelo interativo in vitro foi desenvolvido utilizando o milho (Zea mays spp. mays) híbrido AG-5011, em suas versões transgênica (AG- 5011YG - milho YieldGard®, evento GM MON810) e não-transgênica (AG-5011), aqui definidos como \"híbridos quase-isogênicos\" (HQIs). Foram avaliadas múltiplas fontes de explante, concentrações e combinações de fitorreguladores e outros suplementos no meio de cultura, quanto à eficiência de indução e proliferação de culturas in vitro e à sua ontogênese e morfogênese. Ficaram evidenciadas diferenças ontogenéticas e morfogenéticas significativas entre os HQIs nas respostas a fitorreguladores exógenos, particularmente 2,4-D e 2iP. O mapeamento do perfil protéico de culturas em fase de proliferação, via análise proteômica shotgun seguida de análise de enriquecimento de ontologias gênicas, permitiu elucidar múltiplos processos biológicos, funções moleculares e componentes celulares afetados pela regulação diferencial de proteínas, incluindo metabolismo de carboidratos e energia, metabolismo de proteínas e outras macromoléculas, respostas a estresse e a estímulos, metabolismo de fitorreguladores, entre outros. Com base nos resultados observados, conclui-se que o modelo interativo in vitro é uma ferramenta poderosa e de alta resolução para a identificação de efeitos não-intencionais da transformação genética de plantas, e que a presença do constructo recombinante do milho GM MON810 e a conseqüente expressão constitutiva da proteína Cry1Ab recombinante, está associada a múltiplos efeitos off-target nos níveis molecular, celular e morfogenético do milho híbrido GM AG-5011YG in vitro.

Abstract: This thesis elaborates a model based on plant cell, tissue and organ culture as an alternative for investigation of unintended effects, or emergent properties, in genetically modified (GM) plants. The evaluation of unintended effects in vitro presents potential advantages to ex vitro approaches, including i) the use of a biological model of less complexity than the real system (i.e. cultures of one or a few cell, tissue or organ types, vs. the whole plant in cultivation, with multiple organs, tissues and cell types in interaction); ii) high environmental control, allowing for reliable comparisons between transgenic plants and their conventional counterparts; iii) high resolution of unintended effects in ontogenetic and morphogenetic processes; iv) high biomass growth and proliferation rates; and v) applicability to experimentation. An in vitro interactive model was established using maize (Zea mays spp. mays) hybrid AG-5011, in its transgenic (AG-5011YG - YieldGard® maize, GM event MON810) and non-transgenic (AG- 5011) versions, herein defined as near-isogenic hybrids (NIHs). Multiple explant sources, concentrations and combinations of plant growth regulators and of other culture medium supplements were evaluated regarding effects on in vitro culture induction, proliferation, ontogenesis and morphogenesis. Significant ontogenetic and morphogenetic differences were observed between the tested NIHs in response to exogenous growth regulators, particularly 2,4-D and 2iP. Proteomic profiling of proliferation-stage callus cultures by means of shotgun proteomics and gene ontology enrichment analysis, pointed to a diverse set of biological processes, molecular functions and cellular components affected by differential protein regulation, including carbohydrate and energy metabolism, protein and other macromolecules metabolisms, responses to stress and stimuli, growth regulator metabolism, among others. Based on the observed results, we conclude the developed in vitro model, coupled to thorough experimental design and statistical modeling of developmental, morphogenetic, and biochemical variables, constitutes a powerful, high resolution tool for identification of unintended effects of plant genetic transformation, and that the presence of the recombinant gene construct of GM maize MON810, and the consequent constitutive expression of the recombinant Cry1Ab protein, is associated to multiple off-target effects at the molecular, cellular, ontogenetic and morphogenetic levels of GM maize AG-5011YG in vitro.