Efeitos de diferentes elicitores na produção de compostos fenólicos e atividade antioxidante em culturas celulares de Passiflora setacea (Passifloraceae)

Abstract

Passiflora setacea D.C. (Passifloraceae) é uma espécie endêmica do Brasil, encontrada nos biomas vulneráveis Cerrado, Mata Atlântica e Caatinga. A variedade BRS Pérola do Cerrado foi desenvolvida pelo programa de melhoramento genético da Embrapa Cerrados, visando avaliar o potencial do uso funcional das Passifloras silvestres, por apresentar importantes propriedades bioquímicas, toxicológicas e medicinais. O objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos de tipos de explantes, de diferentes meios de cultura, de concentrações do ácido 2,4-diclorofenoxiacético, de fontes de carbono e de fontes de luz na produção de compostos fenólicos, flavonoides e na atividade antioxidante de extratos de culturas de calos de P. setacea. Os calos obtidos através da cultura in vitro de segmentos de nó cotiledonar e cotilédone de plantas axênicas de P. setacea foram mantidos em meio de cultura Murashige & Skoog, suplementado com 88,5 mM de sacarose, 2,5 µM de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e 0,2% (m/V) de Phytagel. Essa composição de meio de cultura foi mantida em todos os experimentos exceto quando especificado. Foram testados os meios de cultura Murashige & Skoog (MS), Gamborg (B5), Wood Plant Medium (WPM) e White (W); as concentrações 2,5, 5,0 e 10,0 µM de 2,4,-D; as fontes de carbono, de forma isolada, sacarose, trealose, frutose e glicose, e as combinações sacarose-trealose, sacarose-glicose e frutose-glicose; e diferentes tipos de fontes de luz (fluorescente e fluorescente combinada com LED ratio full spectrum). As culturas foram mantidas em sala de crescimento com temperatura controlada 25 ± 2ºC, sob fotoperíodo de 16/8 horas de luz/escuro e umidade relativa de 70%. Após 30 dias de cultivo, os calos foram coletados, secos em estufa a 60°C por 24h e submetidos à extração hidroalcoólica. Os teores de fenólicos totais e flavonoides foram determinados através dos métodos colorimétricos de Folin-Ciocalteu e do cloreto de alumínio, respectivamente, e a avaliação da atividade antioxidante dos extratos mensurada a partir da capacidade de sequestro do radical livre DPPH e do teste do poder redutor. O meio de cultura MS promoveu, em calos de cotilédone, o maior teor de fenólicos totais e a maior atividade antioxidante pelo método do sequestro do radical livre DPPH e, em calos de nó cotiledonar, o maior teor de flavonoides e atividade antioxidante através do poder redutor. O maior teor de fenólicos totais e atividade antioxidante determinada pelo DPPH ocorreu em calos de cotilédone a 2,5 µM e 5,0 µM de 2,4-D, respectivamente, e o maior teor de flavonoides e atividade antioxidante dada pelo poder redutor, em calos de nó cotiledonar a 2,5 µM 2,4-D. A sacarose 88,5 mM estimulou os maiores teores de compostos fenólicos, em calos de cotilédone, e de flavonoides e atividade antioxidante pelo teste do poder redutor, em calos de nó cotiledonar. A glicose 177 mM (calos de nó cotiledonar) e a combinação sacarose-trealose (calos de cotilédone) favoreceram a maior atividade antioxidante pelo DPPH. A combinação fluorescente-LED ratio full spectrum levou ao maior conteúdo de fenólicos totais em calos de cotilédone, em contrapartida, a luz fluorescente promoveu o maior teor de flavonoides e atividade antioxidante pelo poder redutor, em calos de nó cotiledonar, e a maior atividade antioxidante pelo DPPH, em calos de cotilédone. Os resultados indicaram a relevante influência dos tipos de explante, meios de cultura, concentrações de 2,4-D, fontes de carbono e fontes de luz na produção de compostos fenólicos e atividade antioxidante dos extratos de calos de P. setacea e possibilitaram, para cada tipo de calo, a otimização de parâmetros fundamentais para potencializar o desenvolvimento de bioprocessos, para a produção in vitro de biomoléculas de interesse.<br>

Abstract : Passiflora setacea D.C. (Passifloraceae) is a native species from the endangered Brazilian biomas Cerrado, Atlantic Forest and Caatinga. The BRS Pérola do Cerrado variety was developed by the Embrapa Cerrados genetic breeding program aiming to evaluate the potential functional uses of the wild Passifloras, due to their important toxicological, medicinal and biochemichal characteristics. The aim of the work reported here was to investigate the effects of explant type, basal salt culture medium, 2,4-D concentration, carbon sources and light sources in the production of total phenolics, flavonoids and antioxidant potential of callus extracts of P. setacea. Calluses cultures obtained from cotyledonary node and cotyledon segments of axenic seedlings were maintained in Murashige & Skoog basal medium, supplemented with 88,5 mM sucrose, 2,5 µM of de 2,4-diclorophenoxyacetic acid (2,4-D) and 0,2% (m/V) Phytagel. This medium composition was used throughout the experiments except when specified. The culture medium tested were Murashige & Skoog (MS), Gamborg (B5), Wood Plant Medium (WPM) e White (W); the 2.5, 5.0 and 10.0 µM 2,4-D concentrations; the carbon sources sucrose, trehalose, fructose, glucose and the combinations sucrose-trehalose, sucrose-glucose and fructose-glucose; different light sources (fluorescent and the combination fluorescent-LED ratio full spectrum). The cultures were maintained in growth room at 25 ± 2ºC, 16/8h (light/dark) photoperiod and 70% relative humidity. After 30 days of culture the calluses were collect and oven dried at 60°C for 24h and submitted to the hydroalchoolic extraction. The extracts were analysed by Folin Ciocalteu (total phenolics) and aluminium chloride (flavonoids) colorimetric methods and the antioxidant activity was measured by the DPPH free radical scavenging capacity and by de reducing power (ferric ion reduction). The MS basal medium promoted the highest total phenolics and antioxidant activity by DPPH in cotyledon calluses and the highest flavonoids and antioxidant activity by reducing power in cotyledonary node callus. The highest levels of total phenolics and antioxidant activity determined by DPPH occurred in cotyledon calluses at 2.5 µM and 5.0 µM 2,4-D, respectively and the highest flavonoid and antioxidant activity, by reducing power in cotyledonary node calluses at 2.5 µM 2,4-D. Sucrose at 88,5 mM stimulated the highest total phenolic content in cotyledon calluses and the highest flavonoids and antioxidant activity by reducing power in cotyledonary node callus. Glucose at 177 mM (cotyledonary node calluses) and the combination sacarose-trehalose (cotyledon calluses) promoted the highest antioxidant activity by DPPH. The combination fluorescent-LED ratio full spectrum promoted the highest total phenolics levels in cotyledon calluses but fluorescent light promoted the highest flavonoid and antioxidant activity by reducing power in cotyledonary node calluses, and the highest antioxidant activity by DPPH in cotyledon calluses. These results indicated the strong influence of explant type, culture media, 2,4-D concentration, carbon sources and light sources on the production of phenolics and antioxidant activity of the P. setacea calluses extracts and allowed for each callus type the optimization of parameters which are the basis to potencialize the development of bioprocess for in vitro production of biomolecules of interest.