Microanálise mediada por eletroforese capilar (EMMA) e microrreator de enzima imobilizada (IMER) como métodos alternativos para determinação de atividade enzimática

Abstract

Para se fazer a avaliação de atividades biológicas são utilizadas várias técnicas, desde as mais simples até as mais sofisticadas. Ensaios in vitro podem ser realizados na própria bancada do laboratório de química, uma vez que apresentam resultados rápidos e eficazes. Como exemplo, podemos citar ensaios de avaliação da atividade de amostras sobre uma enzima alvo relacionada à algum tipo de condição fisiopatológica. Dentre as técnicas analíticas hoje difundidas pelo meio científico, a eletroforese capilar vem crescendo nas últimas décadas e pode ser empregada para o desenvolvimento de métodos para avaliação de atividades enzimáticas, através de métodos de microanálise mediada por eletroforese capilar (EMMA). Dentre as enzimas importantes em processos fisiopatológicos, destacam-se aqui a acetilcolinesterase (AChE), importante no tratamento da doença de Alzheimer e a a-glicosidase, com participação crítica no diabetes. Portanto, o objetivo do presente trabalho foi desenvolver métodos de EMMA e de microrreator de enzima imobilizada (IMER) aplicados no rastreio de novos agentes terapêuticos aplicados a estas enzimas. Foram desenvolvidas três modalidades de métodos para avaliação de atividade enzimática. Na primeira, foram desenvolvidos dois métodos, um para AChE e outro para a-glicosidase, por injeções múltiplas, para a obtenção de dois resultados em um mesmo experimento. Os métodos tiveram seus parâmetros cinéticos enzimáticos avaliados, com valores de IC50 para neostigmina (inibidor padrão da AChE) e acarbose (inibidor padrão da a-glicosidase) de 14,19 ± 0,028 µmol L-1 e 0,17 ± 0,002 mmol L-1, respectivamente, sendo estes valores condizentes com a literatura (22,2 ± 3,2 µmol L-1 e 0,201 ± 0,019 mmol L-1, respectivamente). Este método foi aplicado em sucos de frutas, destacando-se os de jaboticaba (Plinia cauliflora, que apresentou inibição de 85,90 ± 1,73 % da AChE à 5 mg mL-1) e pitanga (Eugenia uniflora, inibição de 69,47 ± 2,89 % da a-glicosidase à 1 mg mL-1). Vários compostos fenólicos foram identificados nos sucos por HPLC-ESI-MS/MS. Na segunda modalidade, foi desenvolvido um método duplo simultâneo para as mesmas enzimas, que apresentou valor de IC50 de 5,35 µmol L-1 e 0,57 mmol L-1, para os inibidores neostigmina e acarbose, respectivamente. Este método foi aplicado a compostos fenólicos isolados presentes nos sucos de frutas estudados anteriormente, dos quais destacam-se o ácido p-cumárico (inibição de 40,14 ± 4,7 % da AChE à 10 mg L-1) e a quercetina (inibição de 46,53 ± 4,9 % da a-glicosidase à 10 mg L-1). No último estudo, a AChE foi ancorada em nanopartículas magnéticas de ferrita de manganês, que foram utilizadas para o desenvolvimento de um microrreator de enzima imobilizada (IMER). Esse microrreator demostrou boa estabilidade, podendo ser utilizado por aproximadamente até 25 experimentos consecutivos. Por meio deste microrreator, obteve-se uma IC50 para a neostigmina de 29,42 ± 3,88 µmol L-1, demostrando uma maior atividade da enzima na forma imobilizada. Este método por IMER foi aplicado a extratos vegetais de espécies da família Myrtaceae, das quais destacou-se novamente a jaboticaba (P. cauliflora) que inibiu a atividade da AChE em 42,31 ± 6,81 % em uma concentração de 100 mg L-1. Os métodos de EMMA, propostos pela abordagem de injeções múltiplas, e o de IMER, provaram ser ferramentas poderosas para a triagem de atividade inibitória enzimática, por meio das vantagens inerentes a técnica de eletroforese capilar, como a rápida análise e o baixo consumo de amostras e reagentes. Além disso, algumas das amostras aqui estudadas podem ser consideradas para o estudo de seu uso em terapia anti-Alzheimer e anti-diabetes. Estudos futuros podem revelar que estas podem ser utilizadas como alimentos funcionais, ou em tratamentos adjuvantes para as duas doenças aqui mencionadas e possivelmente para outras.<br>

Abstract : In order to evaluate biological activities, several techniques are used, from the simplest to the most sophisticated. In vitro assays can be performed on the chemistry laboratory bench, as they present fast and effective results. As an example, we can cite assays evaluating the activity of a sample on a target enzyme related to some type of pathophysiological condition. Capillary electrophoresis has been growing in the last decades and can be used to develop methods for the evaluation of enzymatic activities through electrophoretically mediated microanalysis (EMMA). Among the important enzymes in pathophysiological processes, acetylcholinesterase (AChE), important in the treatment of Alzheimer's disease; and a-glucosidase, with a critical participation in diabetes, are highlighted here. Therefore, the objective of the present work was to develop EMMA and immobilized enzyme microreactor (IMER) methods applied in the screening of new therapeutic agents. Three modalities of methods for evaluating enzymatic activity were developed. In the first, two methods were developed, one for AChE and one for a-glucosidase, by multiple injections, to obtain two results in the same experiment. The methods had their enzymatic kinetic parameters evaluated, with IC50 values for neostigmine (standard AChE inhibitor) and acarbose (standard a-glucosidase inhibitor) of 14.19 ± 0.028 µmol L-1 and 0.17 ± 0.002 mmol L-1, respectively. These values are consistent with the literature (22.2 ± 3.2 µmol L-1 and 0.201 ± 0.019 mmol L-1, respectively). This method was applied to fruit juices, especially jaboticaba (Plinia cauliflora, which showed inhibition of 85.90 ± 1.73 % of AChE at 5 mg mL-1) and pitanga (Eugenia uniflora, inhibition of 69, 47 ± 2.89 % of a-glucosidase at 1 mg mL-1). Several phenolic compounds were identified in the juice by HPLC-ESI-MS/MS. In the second modality, a double simultaneous method was developed for the same enzymes, which presented IC50 value of 5.35 µmol L-1 and 0.57 mmol L-1, respectively, for neostigmine and acarbose inhibitors. This method was applied to isolated phenolic compounds previously identified in the studied fruit juices, such as p-coumaric acid (inhibition of 40.14 ± 4.7 % of AChE at 10 mg L-1) and quercetin (46.53 ± 4.9 % inhibition of a-glycosidase at 10 mg L-1). In the last study, AChE was anchored in magnetic nanoparticles of manganese ferrite, which were used for the development of an IMER. This microreactor showed good stability and can be used for up to 25 consecutive experiments. By means of this microreactor, an IC50 for neostigmine of 29.42 ± 3.88 µmol L-1 was obtained, demonstrating a greater activity of the enzyme in the immobilized form. This method by IMER was applied to plant extracts of the Myrtaceae family, of which jaboticaba (P. cauliflora) was more prominent, which inhibited AChE activity in 42.31 ± 6.81 % in a concentration of 100 mg L-1. The EMMA methods, proposed by the multiple injection approach, and the IMER, have proven to be powerful tools for the screening of enzymatic inhibitory activity, through the inherent advantages of the capillary electrophoresis technique, such as rapid analysis and low sample and reagents consumption. In addition, some of the samples studied here may be considered for the study of their use in anti-Alzheimer's and anti-diabetes therapy. Further studies may reveal that they may be used as functional foods, or in adjuvant treatments for the two diseases mentioned herein and possibly for others.