Desenvolvimento de modelo de melanoma 3D para screening de drogas anticâncer in vitro

Abstract

O melanoma é o câncer de pele mais grave, pois apresenta alto índice de mortalidade, sendo responsável por 80% das mortes decorrentes de câncer de pele. Isso se deve ao seu comportamento invasivo que leva ao desenvolvimento de metástase. Na metástase, o tumor é capaz de crescer e invadir os tecidos adjacentes chegando à corrente sanguínea e se alastrando em tecidos mais afastados do tumor primário. Atualmente há inúmeros estudos para mimetizar o comportamento tumoral in vivo, usando principalmente esferoides tumorais, visando aperfeiçoar modelos in vitro para compreensão de processos mais complexos, como a invasão tumoral e angiogênese. A fim de auxiliar nesse processo, o presente trabalho tem como objetivo o desenvolvimento de uma plataforma tumoral 3D de modelo de melanoma para screening de drogas anticâncer. Para isso, o colágeno do tipo I (COL) foi imobilizado através de ligações covalentes na estrutura dos hidrogéis de nanocelulose bacteriana (BNC) formando o hidrogel BNC-COL. A imobilização foi confirmada por Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier. A presença de colágeno influenciou diretamente no comportamento celular apresentado pelas células endoteliais de veia umbilical humana (HUVECs) e esferoides de células de melanoma humano (SK-MEL-28) que foi diferenciado do hidrogel de BNC puro. A superfície inferior do hidrogel BNC-COL foi a que apresentou os melhores resultados para ambas as células. As células de SK-MEL-28 mostraram-se capazes de formarem esferoides. Os esferoides foram formados e caracterizados em três tempos distintos, sendo o segundo dia de formação o empregado no modelo 3D. As HUVECs e os esferoides de SK-MEL-28 foram cocultivados em três condições diferentes. A primeira condição consiste em inocular na BNC-COL as duas linhagens ao mesmo tempo. Na segunda condição cultiva-se primeiramente as HUVECs e após 24 h os esferoides de SK-MEL-28 e na terceira condição ocorre o contrário, primeiro são cultivados os esferoides de SK-MEL-28 e após 24 h as HUVECs. As condições de cocultivo foram avaliadas por diferentes técnicas de microscopia. A condição 2 foi a escolhida para ser usada no modelo 3D. Após, o cocultivo foi acompanhado por 7 dias, sendo os dias 1, 3 e 7 analisados. O sétimo dia mostrou a maior área de invasão quantificada pelo software Wimasis e por isso utilizado no modelo 3D. O modelo 3D proposto por esse trabalho obteve um resultado positivo quando em contato com a doxorrubicina (DOX), sendo mais resistente a DOX em comparação com os modelos 2D e esferoides 3D. Logo, a plataforma desenvolvida nesse trabalho mostrou-se promissora para o emprego em screening de drogas anticâncer.

Abstract: Melanoma is the most serious skin cancer because it has a high mortality rate, accounting for 80% of deaths from skin cancer. This is due to their invasive behaviour that leads to the development of metastasis. In metastasis, the tumor can grow and invade adjacent tissues reaching the bloodstream and spreading to tissues farther from the primary tumor. There are currently numerous studies to mimic tumor behavior in vivo, mainly using tumor spheroids, aiming to improve in vitro models to understand more complex processes such as tumor invasion and angiogenesis. In order to assist in this process, the present work aims to develop a 3D tumor platform of melanoma model for anticancer drug screening. For this, type I collagen (COL) was immobilized through covalent bonds in the structure of bacterial nanocellulose hydrogels (BNC) forming the hydrogel BNC-COL. Immobilization was confirmed by FTIR spectroscopy. The presence of collagen directly influenced the cellular behaviour of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) and human melanoma cell spheroids (SK-MEL-28), which was differentiated from pure BNC hydrogel. The bottom surface of the BNC-COL hydrogel showed the best results for both cells. SK-MEL-28 cells were able to form spheroids. The spheroids were formed and characterized in three distinct times, being the second day of formation the employee in the 3D model. HUVECs and SK-MEL-28 spheroids were co-cultured under three different conditions. The first condition is to inoculate on BNC-COL both cell lines at the same time. In the second condition the HUVECs were first cultured and after 24 h the SK-MEL-28 spheroids were cultivated and in the third condition the opposite happens, first the SK-MEL-28 spheroids were cultivated and after 24 h the HUVECs. Co-cultivation conditions were evaluated by different microscopy techniques. Second condition was chosen to be used in the 3D model. The co-cultivation was evaluated in first, third and seventh day. The seventh day showed the largest invasion area quantified by Wimasis software and therefore used in the 3D model. The 3D model proposed in this work obtained excellent results when in contact with doxorubicin (DOX), being more resistant to DOX compared to 2D models and 3D spheroids. Therefore, the platform developed in this study proved to be suitable for use in anticancer drug screening.