Avaliação da atividade leishmanicida in vitro de formas farmacêuticas de Anfotericina B e incorporada em nanopartícula lipídica sólida

Abstract

Espécies de Leishmania são agentes causadores das leishmanioses, classificadas como doenças tropicais negligenciadas. O Brasil é um dos países de maior prevalência nas Américas, onde estão concentrados 90% dos novos casos de leishmanioses, configurando mais de 16 mil novos casos/ ano de Leishmaniose tegumentar. A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) caracteriza-se por lesões cutâneas, com uma depressão central com bordas endurecidas e elevadas. Estas lesões podem desaparecer um tempo após a picada do mosquito, ou podem evoluir para um quadro mucocutâneo ou cutâneo-difuso. Leishmania (Leishmania) amazonensis pode incapacitar a resposta imune do hospedeiro, agravando o quadro clínico e por isso representa uma das espécies mais importantes, pelo alto índice de morbidade. No Brasil, os medicamentos usados no tratamento de LTA são de uso sistêmico, e destaca-se a Anfotericina B associada ao desoxicolato de sódio (AB-DOC) por ser a mais eficiente no tratamento da forma cutâneo-difusa. A AB-DOC é um medicamento antibiótico, associado à cura de lesões cutâneas e de mucosas. Apresenta-se como um desafio do ponto de vista clínico, porque requer altas doses durante um longo período, tornando-se bastante tóxico, especialmente aos rins e fígado. Para solucionar este problema, no mercado farmacêutico encontram-se disponíveis alternativas baseadas em sistemas nanocarreadores, como a Anfotericina B Lipossomal (AmBisome®). Esta formulação lipossomal comparativamente é a mais segura e eficaz, pois apresenta menor toxicidade e melhor biodisponibilidade, porém possui um alto custo e a necessidade de resfriamento. Estes fatores dificultam o amplo acesso da população ao tratamento, o que leva à necessidade de estudos na busca de novas formulações como alternativas. Já foi relatado que o aquecimento de AB-DOC permite a formação de superagregados, que possuem toxicidade reduzida comparada à AB-DOC, sem interferir na atividade biológica do fármaco. Neste estudo, preparou-se uma nanopartícula lipídica sólida associada à AB-DOC (AB-NLS), que apresentou tamanho de partícula (TP) de 77,7 ± 4,1 nm, compatível com o sistema nanoparticulado, índice de polidispersão (PdI) de 0,192 ± 0,040, e potencial zeta (PZ) de -39,2 ± 1,81 mV, mantendo-se estável por 90 dias a 4 °C e protegida da luz. O resultado de TP foi confirmado por microscopia eletrônica de transmissão (MET), mostrando uma população de distribuição homogênea. Os ensaios de atividade biológica com AB-NLS frente a promastigotas de L. (L.) amazonensis mostraram potencial leishmanicida, com valores de CI50 de 353 nM, 458 nM e 1719 nM, e IS de 30, 23 e 6, para tratamentos de 24h, 48h e 72h, respectivamente. Não houve atividade citotóxica frente a macrófagos, nem com altas concentrações-teste (10822nM). O ensaio de hemólise apresentou dados promissores quanto ao potencial uso da formulação via sistêmica, visto que não houve atividade hemolítica frente aos eritrócitos humanos. A produção de TNF-a de 602 ± 48 pg/mL indicou que em testes futuros, a AB-NLS frente a amastigotas intracelulares poderá apresentar atividade. Os resultados demonstraram que AB-NLS apresenta-se eficaz frente as formas promastigotas, mas sem afetar a viabilidade celular de macrófagos.

Abstract: Leishmania species are agents that cause leishmaniasis, classified as neglected tropical diseases. Brazil is one of the countries with the most prevalence on the American continent, a continent that concentrates 90% of the leishmaniasis new cases, concentrating over 16 thousand of new cases per year of tegumentary leishmaniasis. American Tegumentary Leishmaniasis (ATL) is characterized by cutaneous lesions, with a central depression and hardened elevated edges. These lesions may disappear after the mosquito bite or may evolve to a mucocutaneous or cutaneous-diffuse condition. Leishmania (Leishmania) amazonensis may incapacitate the immune response of the host, aggravating the clinical condition and representing one of the most important species, for the high morbidity rate. In Brazil, the drugs used in ATL treatment are of systemic use, and Amphotericin B deoxycholate (AB-DOC) features as the most efficient for cutaneous-diffuse treatment. AB-DOC is an antibiotic, related to the cure of cutaneous and mucocutaneous lesions. It is a challenge from the clinical aspect, because the drug requires high doses during a long period, becoming very toxic, especially to kidneys and liver. To circumvent this problem, the pharmaceutical market provides alternatives based on nanocarriers systems, as liposomal Amphotericin B (AmBisome®). Comparatively, this liposomal formulation is more secure and efficient, presents lower toxicity and better bioavailability, however, has a high cost and the necessity for cooling. These factors impair the wide access to the treatment by the population, leading to the search for new formulations as alternatives. It has been reported that AB-DOC heating allows the formation of super-aggregates, which have lower toxicity compared to AB-DOC, without interfering in its biological activity. In this study, it was developed a solid lipid nanoparticle associated with AB-DOC (AB-SLN), which presented a particle size of 77,7 ± 4,1 nm, compatible with a nanoparticle delivery system, polydispersion index of 0,192 ± 0,040, and a zeta potential of -39,2 ± 1,81 mV, remaining stable for 90 days at 4 °C protected from light. The result of particle size was confirmed by transmission electron microscopy (TEM), demonstrating a homogeneous distribution of the population. The biological activity assays with AB-SLN against L. (L.) amazonensis promastigotes demonstrated a leishmanicidal potential, with IC50 values of 353 nM, 458 nM and 1719 nM, and SI of 30, 23 e 6, for treatments of 24 h, 48 h, and 72 h, respectively. There was no cytotoxic activity against macrophages, not even with the highest test concentration (10822nM). Hemolysis assay showed promising data as for potential systemic use of the AB-SLN formulation, since the formulation presented no hemolytic activity against human erythrocytes. TNF-a production of 602 ± 48 pg/mL was an indicative that it might have activity against intracellular amastigotes. The results inferred that AB-SLN shows efficacy against promastigotes, without affecting macrophages viability.