Mel de melato de bracatinga (Mimosa scabrella Bentham): compostos bioativos, potencial anti-inflamatório e marcadores proteômicos de autenticidade

Abstract

O mel de melato de bracatinga (Mimosa scabrella Bentham) é produzido a partir de excreções da cochonilha Stigmacoccus paranaensis Foldi encontradas no caule desta árvore, que são coletadas pelas abelhas Apis mellifera como matéria-prima para produção de mel. O fenômeno ocorre na região Sul do Brasil e o mel de melato de bracatinga é atrativo para o mercado internacional devido à sua cor escura e sabor diferenciado, quando comparado aos méis de origem floral. Atualmente existe a demanda por estudos que avaliem o potencial benéfico do mel de melato de bracatinga à saúde humana, bem como estratégias que permitam determinar a autenticidade deste produto. Consequentemente, a cadeia produtiva do mel de melato de bracatinga tende a ser fortalecida e alcançar maior visibilidade, representando inúmeras vantagens para os apicultores e para a região Sul do Brasil. Frente ao exposto, os objetivos deste trabalho foram: (i) desenvolver métodos para a extração e separação simultânea de 18 compostos fenólicos em amostras de mel de melato de bracatinga; (ii) avaliar o potencial anti-inflamatório e estabelecer correlação com o perfil de compostos fenólicos; (iii) e determinar marcadores de autenticidade deste produto por meio da análise proteômica. Para estes fins, o planejamento de mistura Simplex-Centroide e o delineamento composto central rotacional foram empregados para otimização do método de separação de compostos fenólicos por HPLCDAD, cuja resposta otimizada foi definida empregando a desirability function (função de desejabilidade). O método foi validado e aplicado para quantificação de amostras de mel de melato de bracatinga, e os resultados foram considerados satisfatórios de acordo com os critérios de validação analítica recomendados pela Eurachem. Paralelamente, o método QuEChERS (rápido, fácil, barato, efetivo, robusto e seguro do inglês Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe) foi modificado a fim de promover uma extração eficiente de compostos fenólicos desta matriz, resultando em uma estratégia de preparo de amostras rápida, simples, de baixo custo e com menor geração de resíduos, aplicado pela primeira vez em amostras de mel de melato de bracatinga. Após a caracterização fenólica as amostras foram avaliadas com relação ao potencial anti-inflamatório in vitro. A inflamação de macrófagos RAW 264.7 foi induzida com lipopolissacarídeo (LPS) e, o mel de melato de bracatinga foi testado em diferentes concentrações como modulador da expressão de óxido nítrico e das citocinas pró e anti-inflamatórias TNF-a, IL-6, MCP-1, IL-12p70, INF-? e IL-10. Catorze das dezesseis amostras avaliadas modularam a secreção dos mediadores inflamatórios, sendo que a composição e concentração de compostos fenólicos destas amostras se mostrou associada à distinção entre a atuação das mesmas. Finalmente, para a determinação de marcadores de10 autenticidade do mel de melato de bracatinga, a análise proteômica não-direcionada realizada durante período de doutorado sanduíche na Universidade de Potsdam, Alemanha, apontou a presença de 6 proteínas distintas, pertencentes ao grupo das proteínas de geleia real (MRJP, do inglês Major Royal Jelly Proteins). A fim de detectar peptídeos identificadores e quantificadores das proteínas encontradas, um método SRM (monitoramento de reação selecionada, do inglês Selected Reaction Monitoring) foi desenvolvido por LC-ESI-QqQMS/MS (cromatografia líquida acoplada a espectrômetro de massas triplo quadrupolo) e validado, o que possibilitou a quantificação dos peptídeos de todas as MRJPs, previamente identificadas. O peptídeo QNIDVVAR da MRJP 4 foi considerado um marcador adequado para o mel de melato de bracatinga. A caracterização bioativa e o potencial anti-inflamatório demonstraram que o mel de melato de bracatinga apresenta efeitos benéficos para a saúde humana e a determinação de um marcador de autenticidade adequado contribui para a valorização comercial e cultural do produto.

Abstract: Bracatinga honeydew honey (Mimosa scabrella Bentham) is produced from excretions of the cochineal Stigmacoccus paranaensis Foldi, found on the stem of this tree. The Apis mellifera bees collect the excretions as raw material for honeydew honey production. The phenomenon occurs in the southern region of Brazil, and bracatinga honeydew honey is attractive to the international market due to its dark colour and distinctive flavour when compared to floral honeys. Currently, there is a demand for studies that evaluate the biological effects of bracatinga honeydew honey on human health, as well as strategies to determine the authenticity of this product. Consequently, bracatinga honeydew honey production chain could be strengthened and achieve greater visibility, representing advantages for beekeepers and the southern region of Brazil as a whole. Given the above, the aims of this work were: (i) develop methods for the simultaneous extraction and separation of 18 phenolic compounds in bracatinga honeydew honey samples; (ii) evaluate the anti-inflammatory potential and establish a correlation with the phenolic compounds profile; and (iii) evaluate authenticity markers for this product through proteomic analysis. For these purposes, the Simplex-Centroid mixture design and the central rotational composite design were used to optimize the method separation for phenolic compounds by HPLC-DAD, whose optimized response was defined using the desirability function. The method was validated and applied to quantify bracatinga honeydew honey samples. The results were considered reliable according to the Eurachem guidelines. At the same time, the QuEChERS was modified to improve the extraction efficiency of phenolic compounds from bracatinga honeydew honey, resulting in a fast, simple, low cost and solvent saver, sample preparation strategy, applied for the first time bracatinga honeydew honey. After the phenolic characterization, the bracatinga honeydew honey samples were evaluated for their anti-inflammatory potential in vitro. For this purpose, RAW 263.7 macrophages were inflamed with lipopolysaccharide (LPS), and bracatinga honeydew honey was tested in different concentrations as a modulator of the nitric oxide, TNF-a, IL-6, MCP-1, IL-12p70, INF-?, and IL-10 expression. Fourteen out of the 16 samples evaluated modulated the secretion of inflammatory mediators, and their phenolic composition was associated with the distinction between their performances. Finally, to determinate the authenticity markers for bracatinga honeydew honey, the untargeted proteomic analysis, performed during sandwich doctoral period at the Potsdam University, Germany, highlighted the presence of 6 distinct proteins, belonging to the major royal jelly proteins (MRJP) group. Identification and quantification of the peptides were made by an SRM method (selected reaction monitoring). It was developed12 by LC-ESI-QqQ-MS/MS and validated, which made it possible to quantify the peptides of all MRJPs, previously identified. The peptide QNIDVVAR from MRJP 4 was considered an adequate marker for bracatinga honeydew honey. The bioactive characterization and the antiinflammatory potential highlighted that the consumption of bracatinga honeydew honey in moderate amounts has beneficial effects on human health. The determination of an appropriate authenticity marker will contribute to the commercial and cultural valorization of the product.