Isolamento e caracterização parcial de um inibidor de alpha-amilase das sementes de Phaseolus lunatus e sua relação com a indução de alpha-amilases nas larvas de Zabrotes subfasciatus

Abstract

O caruncho Zabrotes subfasciatus tem grande impacto econômico uma vez que infesta três das principais espécies de leguminosas cultivadas no Brasil, Phaseolus lunatus, Phaseolus vulgaris e Vigna unguiculata. Eficientes mecanismos de defesa, que não sejam danosos ao meio ambiente e para os humanos e que repelem ou intoxicam estes insetos, podem ser encontrados em substâncias químicas das próprias plantas. Inibidores de alpha-amilase 1 (alpha-AI-1), presentes em sementes de P. vulgaris, são eficazes contra bruquídeos do Velho Mundo como Callosobruchus chinensis e Callosobruchus maculatus, porém, ineficazes contra Z. subfasciatus. Estes toleram a presença do alpha-AI-1 por terem a capacidade de modular a expressão de suas enzimas digestivas. O contato com o alpha-AI-1 promove a expressão e secreção de duas isoformas de alpha- amilase, sendo estas insensíveis à presença deste inibidor de alpha-amilase quando comparada com a isoforma constitutiva. Curiosamente, esta indução também foi observada quando estes insetos foram cultivados em sementes de P. lunatus, onde não há presença de inibidores de alpha-amilase ativos ou de atividade inibitória de alpha-amilase. No entanto, em sementes P. lunatus contém proteínas similares ao aAI de P. vulgaris, posteriormente intituladas de sequências que são relacionadas aos a-AI (?a-amylase inhibitor like? - AIL). Neste trabalho foram explorados os motivos pelo quais as larvas de Z. subfasciatus promovem a indução de isoformas de a-amilases quando cultivados em sementes de P. lunatus. Exploramos a possibilidade de presença de atividade inibitória de a-amilase nas sementes de P. lunatus o que explicariam este evento. No presente trabalho, foi confirmada a presença de indução das duas isoformas de a-amilase quando as larvas de Z. subfasciatus são cultivadas e alimentadas pelas sementes de P. lunatus, que não contem a presença do alpha-AI-1. Também foram identificadas a presença de um inibidor de a-amilase nas sementes de P. lunatus que demonstram serem semelhantes ao alpha-AI-1 de P. vulgaris em relação à parâmetros moleculares e cinéticos. Podendo este ser o principal responsável por promover a modulação de amilases digestivas nas larvas de Z. subfasciatus. A caracterização do inibidor de P. lunatus, pode trazer novas informações em torno da evolução do locus gênico APA dentro do gênero Phaseolus. Não obstante, também aumentar o número de proteínas potencialmente tóxicas de plantas que podem ser usadas em plantas de interesse econômico que são alvos de insetos praga.

Abstract: The Mexican bean weevil Zabrotes subfasciatus has a major economic impact as it infests three of the main legume species grown in Brazil, Phaseolus lunatus, Phaseolus vulgaris and Vigna unguiculata. Effective defense mechanisms that are not harmful to the environment and humans and that repel or poison these insects can be found in the chemicals of the plants themselves. alpha-Amylase inhibitor 1 (alpha-AI-1), present in P. vulgaris seeds, has been shown to be extremely effective against Old World bruchids such as Callosobruchus chinensis and Callosobruchus maculatus, but ineffective against Z. subfasciatus. It tolerates the presence of alpha-AI-1 because it has the ability to modulate the expression of their digestive enzymes. The contact with alpha-AI- 1 promotes the expression and secretion of two alpha?amylase isoforms, which are insensitive to the presence of this alpha?amylase inhibitor when compared to the constitutive isoform. Interestingly, this induction was also observed when these insects were cultivated in P. lunatus seeds, where there is no report of presence of active alpha?amylase inhibitors or alpha?amylase inhibitor activity. However, in P. lunatus seeds it contains proteins similar to the aAI of P. vulgaris, later called a-amylase inhibitor like sequences (AIL). In this work the reasons why Z. subfasciatus larvae promote the induction of alpha?amylase isoforms when cultivated in seeds of P. lunatus were explored. We explored the possibility of presence of alpha?amylase inhibitor activity in P. lunatus seeds, which could explain this event. In this work, the presence of the two alpha?amylase isoforms induction was confirmed when the larvae of Z. subfasciatus are cultivated and fed by the seeds of P. lunatus, which does not contain the presence of alpha-AI-1. The presence of an alpha?amylase inhibitor in the seeds of P. lunatus has also been identified, demonstrating to be similar to alpha-AI-1 of P. vulgaris in relation to molecular and kinetics parameters. This may be the main responsible for promoting the modulation of digestive alpha?amylases in Z. subfasciatus larvae. The complete characterization of the inhibitor of P. lunatus seeds may bring new information about the evolution of the APA gene locus within the Phaseolus genus. However, it also increases the number of potentially toxic plant proteins that can be used in plants of economic interest that are targets of pest insects.