Efeito antitumoral de ácidos graxos de cadeia média e longa e alcaloides ß-carbolínicos presentes na Passiflora edulis f. flavicarpa Degener

Abstract

A extração supercrítica visando extrair compostos bioativos da torta de sementes de Passiflora edulis f. flavicarpa Degener (P. edulis) considerada como um dos resíduos da indústria alimentícia demonstrou ser uma forma eficiente de aproveitamento deste tipo de subproduto. As sementes de P. edulis são fontes promissoras de fitocompostos lipossolúveis, tais como os ácidos graxos. Estes apresentam diversas atividades farmacológicas, nomeadamente atividade anti-inflamatória, antimicrobiana e antitumoral. Além disso, estudos anteriores relatam a presença de alcaloides ß-carbolínicos nas espécies de P. edulis, especialmente o harmano e harmina, que também apresentam inúmeras atividades farmacológicas. Contudo, os prováveis mecanismos de ação responsáveis pelo efeito citotóxico e antitumoral da P. edulis ainda não estão totalmente elucidados. Neste contexto, a primeira parte deste trabalho teve como objetivo avaliar comparativamente o potencial efeito citotóxico e antitumoral dos extratos hidroalcoólico (HCE) e supercrítico (300bar/40°C/CO 2 /5% etanol, SFEtOH) da torta de sementes da P. edulis, utilizando para isto modelos in vitro (células MCF-7) e in vivo (camundongos Balb/c inoculados com células do tumor ascítico de Ehrlich - TAE). Na segunda parte buscou-se analisar a citotoxicidade e o efeito antitumoral dos alcaloides ß-carbolínicos harmano e harmina, buscando os mecanismos moleculares responsáveis por tais efeitos. Para tal foram utilizados os ensaios in vitro (células MCF-7, HeLa, HepG2 e McCoy), moleculares (CT-DNA), in silico (ancoragem e dinâmica molecular) e in vivo (camundongos Balb/c inoculados com células de TAE). Na terceira parte avaliou-se a atividade antiproliferativa e antiangiogênica de ambos os alcaloides ß- carbolínicos, buscando também os mecanismos moleculares responsáveis por estes efeitos. Neste caso, utilizaram-se as células MCF-7 para a realização dos ensaios in vitro e os camundongos Balb/c inoculados com células de TAE foram utilizados nos ensaios in vivo. O extrato SFEtOH demonstrou ser mais ativo em termos de citotoxidade comparativamente ao extrato HCE. De fato, o extrato SFEtOH apresentou maior citotoxicidade dose-tempo- dependente sobre as células MCF-7 (IC 50 em 72h = 264,6 µg/mL). Além disso, o extrato SFEtOH inibiu o crescimento tumoral em 48,5% e aumentou a sobrevida dos animais tratados (200 mg/kg/dia) em aproximadamente 42%. Nas células do TAE, o extrato SFEtOH aumentou a atividade do ciclo redox da glutationa e diminuiu a atividade da TrxR, induzindo assim o estresse oxidativo nestas células com consequente oxidação de lipídios, proteínas e DNA, o que resultou na parada do ciclo celular na fase G2/M e indução de apoptose via mitocondrial. Estes resultados podem ser em parte atribuídos à presença de ácidos graxos de cadeia média e longa, tais como os ácidos láurico, palmítico, oleico, linoleico e mirístico. Adicionalmente, os resultados da segunda parte deste trabalho revelaram que ambos os alcaloides (harmano e harmina) foram citotóxicos para as células tumorais MCF-7, HeLa e HepG2 de maneira dose-tempo-depente. No entanto, a harmina demonstrou ser mais seletiva que o harmano comparativamente às células normais (McCoy). As técnicas espectroscópicas (UV-Visível, fluorescência e dicroísmo circular) e as simulações de ancoragem (AutoDock Vina) e dinâmica molecular (GROMACS), seguida do ensaio do cometa em células MCF-7, demonstraram que a harmina foi capaz de intercalar-se entre os pares de bases do DNA nas regiões ricas em adenina e timina; e em consequência, causou danos irreparáveis que determinaram a fragmentando do DNA. Concomitantemente, a harmina modulou negativamente o mecanismo de reparo de DNA dependente de PARP1, cuja expressão foi diminuída em células MCF-7. Isto resultou na parada do ciclo celular na fase G2/M e apoptose via mitocondrial. Nos ensaios in vivo, a harmina diminuiu o crescimento tumoral em aproximadamente 31% e aumentou a sobrevida dos animais tratados (20mg/kg/dia) em 68,25% quando comparado com o controle negativo. Ademais, os dados da terceira parte deste trabalho demonstraram que, tanto o harmano quanto a harmina apresentaram atividade antiproliferativa sobre as células MCF-7, porém a harmina exibiu um efeito antiproliferativo mais eficaz que o harmano. Além do mais, a harmina diminuiu a expressão e atividade de Akt, por conseguinte diminuiu o conteúdo de HIF-1a independentemente do envolvimento de mTOR, além de diminuir a geração de EROs, levando assim a inibição da via de sinalização PI3K/Akt. Por fim, a harmina também apresentou atividade antiangiogênica in vivo. A dose de 20 mg/kg/dia de harmina inibiu a angiogênese em 42,72%, quando comparado com o controle negativo. Tendo em consideração os resultados obtidos conclui-se que, compostos isolados a partir da torta de sementes de P. edulis f. flavicarpa Degener e o alcaloide ß- carbolínico harmina são possíveis promissores agentes antitumorais que podem ser utilizados futuramente como coadjuvantes aos quimioterápicos convencionais já utilizados na clínica.

Abstract: The application of supercritical extraction aiming to extract bioactive compounds from the seed cake of Passiflora edulis f. flavicarpa Degener (P. edulis) considered as one of the residues of the food industry has proven to be an efficient way of using this type of by- product. P. edulis seeds are promising sources of fat-soluble phyto-compounds, such as fatty acids. These have several pharmacological activities, namely anti-inflammatory, antimicrobial and antitumor activity. In addition, previous studies have reported the presence of ß-carbolinic alkaloids in the species of P. edulis, especially harman and harmine, which also have several pharmacological activities. However, the probable mechanisms of action responsible for the P. edulis cytotoxic and antitumor effect are not yet fully understood. In this context, the first part of this work aimed to comparatively evaluate the potential cytotoxic and antitumor effect of hydroalcoholic (HCE) and supercritical (300bar/40°C/CO 2 /5% ethanol, SFEtOH) extracts from seed cake of P. edulis, using in vitro (MCF-7 cells) and in vivo (Balb/c mice inoculated with Ehrlich ascitic tumor cells - TAE) models. In the second part, we sought to analyze the cytotoxicity and the antitumor effect of the ß-carbolinic alkaloids harman and harmine, researching for the mechanisms of action responsible for such effects. In which were used in vitro (MCF-7, HeLa, HepG2 and McCoy cells), molecular (CT-DNA), in silico (docking and molecular dynamics) and in vivo (Balb/c mice inoculated with TAE cells) assays. The SFEtOH extract was shown to be more active in terms of cytotoxicity compared to the HCE extract. In fact, the SFEtOH extract showed greater dose-time-dependent cytotoxicity on MCF-7 cells (IC 50 in 72h = 264.6 µg/mL). In addition, the SFEtOH extract inhibited tumor growth by 48.5% and increased the survival of the treated animals (200 mg/kg/day) by approximately 42%. In TAE cells, the SFEtOH extract increased the activity of the redox cycle of glutathione and decreased the activity of TrxR, thus inducing oxidative stress in these cells with consequent oxidation of lipids, proteins and DNA, which resulted in the cell cycle arrest in the phase G2/M and apoptosis via mitochondrial. These results can be partly attributed to the presence of medium and long chain fatty acids, such as lauric, palmitic, oleic, linoleic and myristic acids. Additionally, the results of the second part of this work revealed that both alkaloids (harman and harmine) were cytotoxic to tumor cells MCF-7, HeLa and HepG2 in a dose-time-dependent manner. However, harmine proved to be more selective than harman compared to normal cells (McCoy). The spectroscopic techniques (UV-Visible, fluorescence and circular dichroism) and the simulations of docking (AutoDock Vina) and molecular dynamics (GROMACS), followed by the comet assay in MCF-7 cells, demonstrated that the harmine was capable of intercalated between base pairs of DNA in regions rich in adenine and thymine; and as a result, it caused irreparable damage that determined the DNA fragmentation. Concomitantly, the harmine negatively modulated the PARP1-dependent DNA repair mechanism, whose expression was decreased in MCF-7 cells. This resulted in the cell cycle arrest in the G2/M phase and apoptosis via mitochondrial. In in vivo assays, the harmine decreased tumor growth by approximately 31% and increased the survival of the treated animals (20 mg/kg/day) by 68.25% when compared to the negative control. In addition, the data from the third part of this work showed that both harman and harmine showed antiproliferative activity on MCF-7 cells, but harmine exhibited a higher antiproliferative effect. Furthermore, harmine decreased Akt expression and activity, therefore it decreased the HIF-1a content regardless of mTOR and decreased also the generation of EROs, thus leading to inhibition of the PI3K / Akt signaling pathway. Lastly, harmine also showed antiangiogenic activity in vivo. Harmine (20 mg/kg/day) inhibited angiogenesis by 42.72%, when compared to the negative control. Taking into account the results obtained, it is concluded that compounds isolated from the seed cake of P. edulis f. flavicarpa Degener and harmine are possible promising antitumor agents that can be used in the future as adjuvants to conventional chemotherapy drugs already used in the clinic.