A influência do sexo e estádio reprodutivo sobre biomarcadores de exposição e efeito a pireno e fluoreno em ostras do gênero Crassostrea

Abstract

Em Santa Catarina, parte dos cultivos de moluscos marinhos localiza-se próximo a regiões urbanizadas e podem ser impactadas por efluentes com a presença de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs), entre outros xenobióticos. Em bivalves, os HPAs, dentre eles, o pireno (PIR) e o fluoreno (FLU), podem promover alterações nos diversos níveis biológicos. Ostras do gênero Crassostrea, têm sido empregadas como organismos sentinelas em estudos de biomonitoramento ambiental, como as espécies Crassostrea gasar e Crassostrea gigas. Contudo, são raros os estudos que utilizam esses organismos e identificam o sexo e o estádio reprodutivo associado à exposição a esses compostos. Neste estudo, biomarcadores histológicos e moleculares associado ao status reprodutivo de ostras C. gasar e C. gigas expostas a PIR e FLU foi investigado. Em um primeiro experimento ostras C. gasar foram expostas a PIR (0,25 µM e 0,5 µM) e FLU (0,6 µM e 1,2 µM) por 24 e 96h. Ostras C. gasar bioconcentraram mais PIR do que FLU nos tecidos e o estádio reprodutivo de pós-desova possivelmente influenciou a bioconcentração desses contaminantes. Alterações histológicas como atrofia tubular nos divertículos digestivos e aumento de células mucosas no manto foram observadas em animais expostos a PIR. A hibridização in situ, mostrou níveis significativos do sinal de CYP2AU1 em diferentes tecidos de ostras expostas a PIR. Além disso, houve uma correlação positiva entre a atrofia tubular e o sinal de CYP2AU1 nos divertículos digestivos de ostras expostas a PIR, sugerindo a susceptibilidade da espécie a este HPA. Esses resultados sugerem a utilização de biomarcadores histológicos associados ao metabolismo do PIR, mas não ao fluoreno e ainda reforça a importância do gene CYP2AU1 no processo de biotransformação dos HPAs em diferentes tecidos de C. gasar. Em um segundo experimento os efeitos de biomarcadores histológicos na ostra C. gigas foram investigados seguindo o mesmo delineamento experimental do estudo anterior. Ostras C. gigas bioconcentraram PIR e FLU nos tecidos. As ostras em estádio reprodutivo de pós- desova quando expostas a PIR apresentaram atrofia tubular nos divertículos digestivos. Quando expostas a FLU as ostras C. gigas em estádio maduro não apresentaram alterações nos divertículos, porém mostraram aumento nas células mucosas no manto, indicando um possível mecanismo de defesa da espécie contra a exposição a esse HPA. Esses resultados sugerem que PIR e FLU causam diferentes efeitos nos tecidos das ostras C. gigas e que os estádios reprodutivos podem influenciar a forma como as ostras respondem à exposição aos HPAs. No terceiro experimento, o gênero das ostras foi previamente identificado através de procedimentos anestésicos. Fêmeas e machos de C. gasar em estádio de pré-desova foram expostos a PIR (0,25 e 0,5 µM) por 24h. Fêmeas e machos bioconcentraram PIR em seus tecidos. Níveis de transcritos de genes de biotransformação, mecanismos de estresse e ligados à reprodução foram avaliados, mas apenas o CYP2AU1 foi induzido em machos, assim como, alterações como a atrofia tubular foi observada em machos expostos a PIR. Esses resultados sugerem o gene CYP2AU1 como potencial biomarcador de contaminação por HPA em C. gasar e destacam-se o estado reprodutivo e o sexo como fatores a serem considerados nas análises das respostas de biomarcadores em condições de laboratório. Em conclusão, considerando a necessidade de integração entre biomarcadores químicos, moleculares e histológicos e a importância do gênero e status reprodutivo em estudos de biomonitoramento, este trabalho mostra que, ostras C. gasar e C. gigas diferem quanto aos resultados apresentados, que o estádio reprodutivo pode influenciar na bioconcentração, nas alterações em tecidos como o divertículo e o manto nas condições experimentais apresentadas.

Abstract: In Santa Catarina, part of marine mollusks farms is located close to urbanized regions and therefore can be impacted by effluents with the presence of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH), among other xenobiotics. In bivalves, PAH, among them, pyrene (PYR) and fluorene (FLU), can promote changes at different biological levels. Oysters of the genus Crassostrea, have been used as sentinel organisms in studies of environmental biomonitoring, such as the species Crassostrea gasar and Crassostrea gigas. However, studies using these organisms are rare concerning of identification of sex and reproductive behavior associated with exposure to these compounds. In this study, histological and molecular biomarkers associated with the reproductive status of oysters C. gasar and C. gigas exposed to PYR and FLU were investigated. In a first experiment oysters C. gasar were exposed to PYR (0.25 µM and 0.5 µM) and FLU (0.6 µM and 1.2 µM) for 24 and 96h. Oysters C. gasar bioconcentrated more PYR than FLU in tissues and the post-spawning reproductive stage possibly influenced the bioconcentration of these contaminants. Significant histological changes such as tubular atrophy in digestive diverticula and increased number of mucous cells in the mantle were observed in animals exposed to PYR. In situ hybridization showed the significant presence of CYP2AU1 transcripts in different tissues of PYR exposed oysters. In addition, there was a positive and significant correlation between tubular atrophy and CYP2AU1 hybridization signal of oysters exposed to PYR, suggesting susceptibility of this species to this PAH. These results suggest an important role of the use of histological biomarkers associated with PYR metabolism but not FLU and further reinforce the role of CYP2AU1 gene in the biotransformation process of PAH in diferents tissues of C. gasar. A second experiment investigates the effects of histological biomarkers on oyster C. gigas following the same experimental design as the previous study. Oysters C. gigas bioconcentrated PYR and FLU in tissues. Oysters at post-spawning reproductive stage when exposed to PYR showed tubular atrophy in the digestive diverticula. When exposed to FLU, mature oysters C. gigas showed no alterations in diverticulum, but showed an increase of mucous cells in the mantle, demonstrating a defense mechanism of the species against exposure to this PAH. These results suggest that PYR and FLU cause different effects in tissues of C. gigas and that reproductive stages may potentially change the way oysters respond to PAH exposure. In the third experiment, the sex of oysters was previously identified through anesthetic procedures. Females and males of oyster C. gasar at pre-spawning stage were exposed to PYR (0.25 and 0.5 µM) for 24 h. Females and males bioconcentrated PYR in their tissues. Biotransformation gene levels, stress mechanisms and involved in reproduction were evaluated, but only CYP2AU1 was induced in males, as well as tissue alterations such as tubular atrophy were only observed in males exposed to PYR. These results suggest the CYP2AU1 gene as a potential biomarker of PYR exposure in C. gasar and the reproductive state and sex stand out in the analysis of biomarker responses under laboratory conditions. In conclusion, considering the need for integration molecular and histological biomarkers with chemical data and the importance of gender and reproductive status in biomonitoring studies, this work shows that oysters C. gasar and C. gigas differ in terms of the results presented, that the reproductive stage can influence bioconcentration, changes in tissues such as diverticulum and mantle in the experimental conditions presented.