Potencial ação antiviral e citotóxica de novos derivados semissintéticos de cardenolídeos

Abstract

Nos últimos anos, novas possibilidades terapêuticas foram apresentadas para os cardenolídeos, amplamente utilizados como agentes inotrópicos positivos, tais como os efeitos antivirais, citotóxicos e antitumorais. Nesse sentido, com o objetivo de contribuir para o aumento do conhecimento sobre este tema, 16 novos derivados de cardenolídeos foram obtidos a partir da digitoxigenina e foram submetidos às triagens citotóxica, anti-herpética e anti-influenza. Como resultado das três triagens, dois compostos: C10 {3ß-[(N-(2-hidroxietil)aminoacetil]amino-3-deoxidigitoxigenina} e C11 {3ß-(hidroxiacetil)amino-3-deoxidigitoxigenina}, destacaram-se por suas potentes ações e foram selecionados para a elucidação dos mecanismos das ações anti-herpética, anti-influenza e citotóxica, utilizando diferentes estratégias metodológicas. Na primeira abordagem, C10 e C11 interferiram, principalmente, nas etapas intermediárias e finais da replicação do HSV, ou seja, na replicação do DNA viral [HSV-1 (cepa KOS)] por inibirem completamente a expressão das proteínas (ß) UL42 e (?) gD e, parcialmente, da proteína (a) ICP27; além de interferirem na montagem e na liberação das novas partículas virais e reduzirem, quase que totalmente, a propagação intercelular viral [HSV-1 (cepas KOS e 29-R) e HSV-2 (cepa 333)]. Esses compostos não apresentaram efeitos profiláticos em relação aos HSV-1 e HSV-2, não inativaram diretamente esses vírus, e não interferiram nas etapas iniciais da replicação (adsorção, pós-adsorção e penetração viral). Em relação aos vírus influenza, C10 e C11 apresentaram efeitos anti-influenza, especialmente para os vírus do tipo A [cepa A/WSN/33(H1N1)] por reduzirem a expressão das proteínas virais (PB1, NP e NS1) nos estágios iniciais do ciclo de replicação, a transcrição do RNA e, consequentemente, a síntese de novas proteínas virais. Tal ação foi devida à interferência na montagem do complexo da polimerase viral, resultando em uma atividade enzimática deficiente e, portanto, reduzindo a replicação viral. Ainda, esses compostos (especialmente C10) reduziram, de forma significativa, a replicação dos vírus influenza do tipo A [cepa A/Panama/2007/1999 (H3N2)] em um relevante modelo ex vivo de pulmão humano isento de células tumorais, confirmando os resultados obtidos in vitro. Quanto aos efeitos citotóxicos, apenas o C10 foi selecionado para a investigação do mecanismo de morte por ele causado, em células não pequenas de pulmão humano H460. Esse composto induziu um aumento significativo dessas células na fase subG1 do ciclo celular, assim como das células apoptóticas precoces e tardias por meio da externalização da fosfatidilserina, e dos núcleos pequenos e irregulares; característico de apoptose. Tal morte celular foi confirmada pelo ensaio das caspases-3/7. O C10 também reduziu o potencial proliferativo a longo prazo e induziu uma diminuição significativa, tanto da área quanto da viabilidade celular no modelo tridimensional de tumor (esferoides). Ainda, C10 e C11 apresentaram os maiores potenciais de inibição da Na+/K+-ATPase, sendo que tal potencial se correlaciona adequadamente com as bioatividades demonstradas para esses compostos contra as diferentes células tumorais humanas testadas, bem como contra a replicação dos HSV tipos 1 e 2 e dos vírus influenza. Nesse contexto, os compostos C10 e C11 podem ser considerados candidatos promissores a serem explorados na pesquisa e desenvolvimento de novos agentes antivirais e quimioterápicos.

Abstract: In recent years, new therapeutic possibilities were proposed for cardenolides traditionally used to treat heart diseases, such as anticancer and antiviral activities. In this sense, 16 new cardenolide digitoxigenin-derivatives were obtained, and submitted to cytotoxic, anti-herpes and anti-influenza screenings. Two derivatives emerged as the most promising compounds from these screenings: C10 {3ß-[(N-(2-hydroxyethyl)aminoacetyl]amino-3-deoxydigitoxigenin} and C11 {3ß-(hydroxyacetyl)amino-3-deoxydigitoxigenin}. They were selected to have their mechanism of anti-HSV, anti-influenza and cytotoxic actions elucidated by using different methodological strategies. In the first approach, the results demonstrated that C10 and C11 interfere with the intermediate and final steps of HSV replication that is the viral DNA replication [HSV-1 (KOS strain)] by completely abolishing the expression of (ß) UL42 and (?) gD proteins, and partially reducing that of (a) ICP27; as well as with the assembly and release of new virions, and with cell to cell spread [HSV-1 (KOS and strains 29 -R) and HSV-2 (strain 333)]. Additionally, they were not virucidal, had no HSV-1 and HSV-2 prophylactic effects, and did not interfere with the early stages of viral replication (adsorption, post-adsorption and penetration). Regarding the anti-influenza effects, C10 and C11 showed anti-influenza A [strain A/WSN/33(H1N1)] virus activity by reducing the expression of viral proteins (PB1, NP and NS1) at the earlier stages of replication cycle, the RNA transcription and, consequently, the synthesis of new viral proteins. Such antiviral action occurred due to the interference in the assembly of viral polymerase resulting in a deficient enzymatic activity and, therefore, reducing viral replication. Attesting all these results obtained in vitro, a clinically relevant model of influenza infection by using ex vivo human tumor-free lung tissues confirmed the potential of these compounds, especially C10, by reducing influenza virus A [strain A/Panama/2007/1999 (H3N2)] replication. Concerning the cytotoxic effects, only C10 was selected to investigate the mechanism by which cytotoxicity was induced on non-small human lung cells H460. This compound induced a significant increase of H460 cells in subG1, as well as in the number of early and late apoptotic cells, and the small and irregular nuclei; which are characteristics of apoptosis. This type of cell death was confirmed by caspases 3/7 assay. C10 also reduced H460 cells proliferative potential by long-term action and significantly decreased the area and viability of H460 spheroids. In addition, C10 and C11 showed the highest ability to inhibit Na+/K+-ATPase, and such inhibition rate correlates suitably with the bioactivities demonstrated by both compounds against the different human cancer cells tested as well as against HSV types 1 and 2, and influenza virus replication. In this context, they can be considered promising compounds to be explored in the research and development of new antiviral and chemotherapeutic agents.