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Introdução Não é atual o fato de que enzimas vêm sendo utilizadas para substituir catalisadores químicos convencionais. As enzimas apresentam um alto grau de especificidade, seletividade e são capazes de biocatalisar reações em condições mais brandas de pH e temperatura do que os catalisadores químicos. A lacase (EC 1.10.3.2) é uma enzima extracelular da classe das oxirredutases que contém quatro cobres em seu sítio catalítico. Essas enzimas são capazes de catalisar a oxidação de compostos fenólicos, como mono-, di- e polifenóis, aminofenóis, metoxifenóis e aminas aromáticas, com a redução de quatro elétrons do oxigênio formando água, sem o uso de peróxido de hidrogênio. Além disso, na presença de um mediador que aumenta seu potencial redox, possui também a capacidade de catalisar a oxidação de compostos não fenólicos. Esta enzima tem sido investigada em muitas pesquisas devido a sua versátil aplicação. São usadas para síntese de corantes, na síntese de compostos farmacêuticos, na clarificação de vinhos e sucos assim como no tratamento de efluentes, para degradar compostos recalcitrantes que o tratamento convencional não é capaz. No entanto, o uso de enzimas como as lacases em seu estado livre se torna limitado pois são sujeitas à inativação por diversos fatores químicos, físicos e biológicos durante a aplicação catalítica ou durante seu armazenamento. Como uma alternativa para melhorar a estabilidade operacional das enzimas, as mesmas vêm sendo imobilizadas em suportes sólidos, que, além de melhorar as propriedades da enzima também possibilitam o reuso das mesmas em sucessivos ciclos catalíticos. Diversos tipos de suporte vêm sendo desenvolvidos com este propósito. Estes suportes podem ser sintetizados a partir de vários materiais: orgânicos (naturais ou sintéticos), inorgânicos, assim como híbridos e compósitos. Dentre eles estão os polímeros sintéticos, versáteis materiais que podem ser sintetizados de inúmeras formas e que possuem grupos funcionais em suas superfícies, o que facilita a ligação da enzima com o suporte. Um polímero que tem sido utilizado com sucesso para processos de imobilização são as espumas de poliuretano (PUF). Estas espumas são resistentes a solventes e também são biocompatíveis. São obtidas reagindo um diol com um diisocianato. Considerando isso, o presente trabalho teve como objetivo imobilizar a enzima lacase em espumas rígidas de poliuretano, uma comercial e uma obtida a partir de óleo vegetal, usando um biopoliol obtido a partir da glicerólise enzimática do óleo de mamona. Além disso, as condições ótimas de pH e temperatura, estabilidade de armazenamento e reutilização foram investigadas usando 2,2-azinobis-3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato (ABTS) como substrato. Também foi realizado um estudo cinético para ambos os derivados enzimáticos obtidos. Objetivos Objetivo geral Realizar a imobilização in situ da enzima lacase em espumas rígidas de poliuretano comercial e obtida a partir da glicerólise enzimática de óleo vegetal. Objetivos específicos ? Avaliar a atividade enzimática da lacase livre e imobilizada, diante de diferentes parâmetros físicos e químicos; ? Caracterizar os suportes desenvolvidos por morfologia (SEM) e superfície (FTIR); ? Determinar os parâmetros cinéticos (Km e Vmax), a energia de ativação (Ea) e a entalpia de ativação (?H *) em relação ao substrato; ? Avaliar a reutilização do biocatalisador após imobilização em espumas de poliuretano. Metodologia Para a obtenção do biopoliol usado na síntese da espuma de poliuretano obtida a partir de óleo vegetal, foi realizada a glicerólise enzimática do óleo de mamona. A reação foi conduzida em reator de vidro encamisado, com agitação mecânica a 2500 rpm, 70 °C por 3 h, utilizado lipase (Novozym 435) como biocatalisador. Depois do término da reação, a lipase foi separada por filtração a vácuo. Posteriormente, o produto obtido (biopoliol) foi separado em um funil de separação. Lacase de Trametes versicolor foi imobilizada por aprisionamento através da polimerização em massa em reação de uma etapa durante a síntese das espumas de poliuretano. A concentração de enzima foi variada de 0.1 a 0.3 wt% em relação à massa total de monômeros. Em ambas as imobilizações, a lacase liofilizada foi adicionada ao poliol e posteriormente foi adicionado o diisocianato. A imobilização da lacase em espuma comercial (Lac-PUF) foi realizada utilizando diisocianato e poliol comercial, em uma proporção 77 g de NCO por 100 g de OH. Os reagentes foram agitados mecanicamente (2500 rpm) por 60 segundos. A imobilização da lacase em poliuretano feito a partir de óleo vegetal (Lac-bioPUF) ocorreu utilizando o biopoliol sintetizado, 1 wt% de água como agente expansor e diisocianato, em uma proporção 1:1 NCO:OH. Os reagentes foram agitados mecanicamente (2500 rpm) por aproximadamente 90 segundos. Os suportes com e sem enzima foram caracterizados por espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) e por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Para avaliar a eficiência do processo de imobilização, foram realizadas análises da atividade enzimática da lacase frente à diferentes condições químicas e físicas. A medida de atividade foi realizada avaliando a oxidação do 2,2-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate (ABTS). A influência da temperatura na atividade da enzima livre e imobilizada foi investigada em 20, 30, 40 e 50 °C, utilizando tampão pH 4 citrato-fosfato 0.1 M. A energia de ativação (Ea) e a entalpia de ativação (?H*) foram calculadas. O efeito do pH foi avaliado a 40 °C para tampão citrato-fosfato (0.1M) em pH 3, 4, 5 e 6. Os parâmetros cinéticos de Michaelis-Menten, a constante de afinidade enzima-substrato (Km) e a velocidade máxima catalítica (Vmax) foram calculados a partir dos resultados de atividade enzimática para diferentes concentrações de substrato (1.25 até 10 mM de ABTS em solução aquosa). A estabilidade operacional foi avaliada através de sucessivos ciclos de oxidação do ABTS. A estabilidade ao armazenamento da enzima imobilizada foi investigada medindo a atividade da lacase imobilizada armazenada em temperatura ambiente e em geladeira (4 °C) ao longo de 30 dias. Resultados e Discussão A partir dos dados obtidos para o processo de imobilização, a utilização de lacase a uma concentração de 0.2 wt% apresentou resultados promissores. Quando a concentração de lacase foi 0.3 wt% uma diminuição na atividade enzimática foi observada. Com os resultados para a caracterização dos suportes pôde-se observar que a enzima foi imobilizada em ambas as espumas de poliuretano e sem modificar a estrutura das células poliméricas. Depois de imobilizada, a enzima apresentou diferentes atividades frente às temperaturas analisadas. A lacase livre e imobilizada em espuma de poliuretano comercial (Lac-PUF) apresentaram maior atividade a 50 °C enquanto a lacase imobilizada em espuma de poliuretano obtida a partir de óleo vegetal (Lac-bioPUF) apresentou maior atividade a 40 °C. Os valores calculados para Ea e ?H* foram menores para a enzima imobilizada (Lac-PUF e Lac-bioPUF) que para a lacase livre, indicando que o processo de imobilização diminuiu a energia necessária para ativar o complexo enzima-substrato. Frente aos diferentes pHs testados, os resultados obtidos indicaram que a imobilização em ambos os suportes deslocou o pH ótimo da enzima para pH 4, sendo que ela livre apresentou maior atividade em pH 3. Os parâmetros cinéticos de Michaelis-Menten foram calculados a partir da linearização de Lineweaver-Burk. Os valores de Km da Lac-PUF (5 mM) aumentaram 1.8 vezes e 11.2 vezes para a Lac-bioPUF (30 mM) comparado com a enzima livre (2.67 mM), indicando uma diminuição na afinidade da lacase com o substrato usado após o processo de imobilização. No entanto, os valores obtidos para Vmax da Lac-PUF e Lac-bioPUF aumentaram depois da imobilização. Estes resultados indicam que o procedimento de imobilização causou modificações opostas na afinidade (Km aumentou, afinidade diminuiu) e na máxima capacidade catalítica (aumentou), o que influencia o tempo da biocatálise. No final de 30 dias de armazenamento em temperatura ambiente, a lacase imobilizada, Lac-PUF e Lac-bioPUF, reteve 35 e 25% da atividade inicial, respectivamente. Já quando armazenada a 4 °C, 53 e 25% de atividade residual foi observado para Lac-PUF e Lac-bioPUF, respectivamente. A determinação da estabilidade operacional do biocatalisador é importante para determinar a força de ligação entre a enzima e o suporte. Quando a capacidade de reuso da enzima imobilizada foi avaliado, observou-se que depois de dois ciclos catalíticos, ambas as espumas utilizadas para imobilização permitiram que a lacase mantivesse aproximadamente 60% da atividade apresentada no primeiro ciclo. Não obstante, os biocatalisadores puderam ser facilmente separados do meio reacional. Considerações Finais ? A lacase de Trametes versicolor foi imobilizada in situ com sucesso utilizando espumas rígidas de poliuretano comercial e obtida a partir de óleo vegetal como suportes. ? A partir dos dados apresentados, pode-se concluir que o melhor suporte para imobilização de lacase foi a espuma de poliuretano comercial. ? Em geral, ambas as espumas de poliuretano demonstraram melhorar as propriedades enzimáticas e possibilitaram sua reutilização. ? Este estudo sugeriu que esses biocatalisadores têm grande potencial para serem projetados para um reator de leito empacotado e, em seguida, serem usados em sucessivas reações catalíticas de biodegradação.<br> |
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Abstract: Laccases are important biocatalysts due to their ability to oxidize complex phenolic molecules using molecular oxygen and without the need for hydrogen peroxide. Its application includes the clarification of juices and wines, the treatment of residues with the degradation of dyes, the treatment of water with the removal of endocrine disruptors and micro pollutants, as well as several others. To improve its properties and facilitate its use, the laccase immobilization on supports has been done. In this work, the Trametes versicolor laccase was successfully immobilized in situ in rigid foams of commercial polyurethane and derived from vegetable oil (Lac-PUF and Lac-bioPUF). The enzymatic concentration in the immobilization process was investigated. Studies to select the laccase concentration in the supports showed that the best activity was obtained with 0.2% by weight for both foams. Degradation tests using 2,2'-azino-bis- (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) as a substrate were carried out at different temperatures. Through the Arrhenius plot, the activation energy was calculated. After immobilization, the activation energy was reduced from 15.68 kJ?mol-1 of the free enzyme to 9.97 kJ?mol-1 and 10.94 kJ?mol-1 for Lac-PUF and Lac-bioPUF, respectively. Compared to the free enzyme, the immobilized laccase showed a higher Km value and a higher Vmax value, which indicates that after the immobilization procedure, the laccase decreased the affinity for the substrate, but showed an increase in catalytic activity. This increase may be related to the hydrophobic character of the foams. The storage studies showed that Lac-PUF and Lac-bioPUF could be used for 30 days, when stored at room temperature, with retained activity of 35% and 25%, and, when evaluated the stability of enzymatic derivatives packaged under refrigeration (4 °C), the measured activities were 53% and 25% in relation to their initial activity, respectively. The immobilized laccase retained approximately 60% of the initial activity after two cycles of ABTS oxidation. The laccase immobilization procedure allowed for easy separation of the enzyme from the reaction mixture, as well as its reuse. The results obtained allows the immobilization and packaging in situ of the biocatalyst in a tubular reactor, providing its use in several applications of industrial interest. |
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