Estabilização e imobilização de peroxidase em compósito óxido de grafeno-líquido iônico

Abstract

Os nanomateriais baseados em carbono têm sido frequentemente alvo de estudo, os quais vêm apresentando efeitos positivos quanto à aplicação em processos enzimáticos. O óxido de grafeno (GO) é um promissor representante desta classe de nanomateriais. Grupos oxigenados presentes na superfície e extremidades das nanofolhas podem ser constituídos por grupos epóxi, carbonila, carboxila e hidroxila, os quais aumentam a reatividade da matriz. Além disso, grupos oxigenados promovem a funcionalização da superfície, bem como aumentam a área explorável. Uma das aplicações destes nanomateriais está ligada à imobilização de enzimas. Apesar dos ganhos operacionais adquiridos pela imobilização, enzimas são sistemas não estáveis e, portanto, existe um campo a ser explorado na busca de substâncias que desempenhem um papel na sua estabilização. Assim, os líquidos iônicos (ILs) são uma nova classe de solventes, os quais são formados por íons e pares de íons, exclusivamente. Os ILs oferecem novas possibilidades para aplicação como solventes combinados para reações biocatalíticas, pois é possível ajustar a propriedade de solubilidade usando diferentes combinações de cátions/ânions, permitindo uma otimização sistemática. O uso de ILs juntamente com uma matriz sólida torna possível a imobilização, uma vez que os ILs podem atuar como entrecruzadores entre a matriz e a enzima. Diante deste contexto, o objetivo deste trabalho foi desenvolver um compósito GO-IL-COOH para imobilização e estabilização da enzima Horseradish peroxidase (HRP). O GO foi sintetizado via método de Hummers. As condições dos agentes oxidantes da síntese foram otimizadas com o auxílio de um planejamento fatorial completo, 23 com adição e repetição do ponto central, e o uso da aproximação de desejabilidade. O IL sintetizado (cloreto de 1-(3-trimetoxisililpropil)imidazol) foi inserido na superfície do GO, reagindo com os grupos hidroxila e epóxi em ambos os lados do GO. Desta forma, o GO ficou funcionalizado em ambos os lados e nas extremidades das nanofolhas. Para a imobilização covalente da HRP, a qual foi usada como enzima modelo, e foi utilizado o sistema EDC/NHS. O estudo foi conduzido comparando o comportamento da enzima HRP livre e imobilizada, no compósito desenvolvido (GO-IL-COOH-HRP) e no GO otimizado (GO-HRP). Os resultados mostraram que a síntese do GO é reprodutível, sendo a condição otimizada igual a 33:0,5:5,0 (v/m/m) de H2SO4, NaNO3 e KMnO4, respectivamente. A inserção do IL é bastante simplificada quando utilizada a catálise ácida de Bronsted, obtendo-se carregamento de 2,71 ± 0,26 mmol g-1, cerca de 65% maior do que reportado por outros autores utilizando o mesmo método. Nas condições de imobilização estudadas, foi obtido um carregamento de HRP iguais a 316,4 e 186,9 mg g-1, para o GO-HRP e GO-IL-COOH-HRP, respectivamente. Ambas imobilizações apresentaram eficiência de imobilização iguais a 16,16 e 12,08% e atividade recuperada iguais a 8,92 e 5,07%, para GO-HRP e GO-IL-COOH-HRP, respectivamente. No entanto, foi possível avaliar o comportamento das enzimas imobilizadas frente a vários compostos fenólicos, fenol, 2,4-diclorofenol, pirogalol e guaiacol. A enzima imobilizada no compósito apresentou maior estabilidade na degradação de pirogalol e 2,4-diclorofenol durante 20 ciclos reacionais e semelhante comportamento ao GO-HRP na degradação de fenol, durante 8 ciclos, e guaiacol, durante 5 ciclos. O GO-IL-COOH-HRP também apresentou maior estabilidade de estocagem durante 88 dias, nas temperaturas de 3 °C e 22 °C. De forma geral, foi verificado que o IL proporciona um ganho em termos de estabilidade operacional quando comparada ao sistema com apenas óxido de grafeno.

Abstract: Carbon-based nanomaterials have frequently been studied, showing positive effects in terms of enzymatic processes application. Graphene oxide (GO) is a promising representative of this class of nanomaterials. Oxygenated groups on the surface and edges of the nanosheets are associated with epoxy, carbonyl, carboxyl and hydroxyl groups, which increase the reactivity of the matrix. Moreover, oxygenated groups promote the functionalisation of the surface, as well as increase the exploitable area. The enzyme immobilisation is one of these nanomaterials application. Despite the operational gains acquired by immobilisation, enzymes are non-stable systems and, therefore, there is a field to be explored in the search for substances that play a role in their stabilisation. Therefore, ionic liquids (ILs) are a new class of solvents, which are exclusively constituted by ions and ion pairs. The ILs application involves their use as combined solvents for biocatalytic reactions since it is possible to adjust the solubility property using different combinations of cations/anions, allowing systematic optimisation. The use of ILs combined with a solid matrix makes immobilisation possible since ILs can act as a crosslinker between the matrix and the enzyme. In this context, this study aimed to develop a GO-IL-COOH composite for immobilisation and stabilisation of the enzyme Horseradish peroxidase (HRP). GO was synthesised using the Hummers method. Synthesis conditions were optimised according to a full factorial experiment 23, including the repetition of the central point, and the use of the desirability approach. The synthesised IL (1-(3-trimethoxysilylpropyl)imidazole chloride) was inserted on the GO surface, reacting with the hydroxyl and epoxy groups on both sides of the GO. In this way, the GO was functionalised on both sides and at the edges of the nanosheets. For the covalent immobilisation of HRP, which was the model enzyme in this work, we considered the EDC/NHS system. The study was conducted comparing the behaviours of the free and immobilised HRP enzyme, in the developed composite (GO-IL-COOH-HRP) and the optimised GO (GO-HRP). The results showed that the GO synthesis is reproducible, with the optimised condition being 33:0.5:5.0 (v/w/w) of H2SO4, NaNO3 and KMnO4, respectively. The insertion of IL is greatly simplified when using Bronsted acid catalysis, obtaining a loading of 2,71 ± 0,26 mmol g-1, around 65% higher than that reported by other authors using the same method. Under the studied immobilisation conditions, a loading of HRP equal to 316.4 and 186.9 mg g-1 was obtained, for GO-HRP and GO-IL-COOH-HRP, respectively. Both immobilisations showed immobilisation efficiency equal to 16.16 and 12.08% and recovered enzyme activity of 8.92 and 5.07%, for GO-HRP and GO-IL-COOH-HRP, respectively. However, it was possible to evaluate the behaviour of immobilised enzymes against various phenolic compounds such as phenol, 2,4-dichlorophenol, pyrogallol and guaiacol. The enzyme immobilised in the composite showed more excellent stability in the degradation of pyrogallol and 2,4-dichlorophenol during 20 reaction cycles and similar behaviour to GO-HRP in the degradation of phenol, during 8 cycles, and guaiacol, during 5 cycles. GO-IL-COOH-HRP also were more stable during storage for 88 days, at temperatures of 3 °C and 22 °C. In general, we observed that IL improves the operational stability when compared to the system containing only graphene oxide.