Avaliação do efeito in vitro de compostos isolados de algas marinhas pardas sobre a hemostasia humana

Abstract

Os eventos trombóticos representam um grave problema de saúde pública em âmbito global. Tais eventos podem ser prevenidos e tratados com fármacos antitrombóticos, entretanto, esses medicamentos possuem limitações de uso e efeitos adversos. Nesse contexto, a busca por novos agentes com propriedades antitrombóticas em produtos naturais representa uma área de interesse, e o ambiente marinho abrange uma série de organismos com moléculas bioativas que desempenham uma vasta gama de atividades farmacológicas. Diante disso, este trabalho teve como objetivo investigar o efeito dos compostos stypoldiona (C01) e fucosterol (C02), provenientes das algas marinhas Stypopodium zonale e Dictyopteris jolyana, respectivamente, sobre a agregação plaquetária e a coagulação sanguínea humana. Os estudos in silico sugeriram que os compostos possuem boa biodisponibilidade oral e um perfil toxicológico adequado para posteriores ensaios in vitro. A atividade in vitro sobre a coagulação foi avaliada pelos testes de tempo de protrombina (TP) e tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPa), enquanto o efeito sobre a agregação plaquetária foi avaliado pela agregação induzida por difosfato de adenosina (ADP), epinefrina ou colágeno. Previamente à realização de todos os ensaios, as amostras de plasma pobre ou rico em plaquetas foram incubadas por 5 minutos a 37 °C com os compostos (500 µM) ou com dimetilsulfóxido 0,5% (controle). O tratamento com C01 prolongou significativamente o TP (CE50 de 236,7 ± 1,26 µM), enquanto o C02 não apresentou atividade anticoagulante promissora. Ambos os compostos inibiram de forma significativa a agregação plaquetária induzida por todos os agonistas testados. O C01 apresentou atividade antiagregante mais promissora que o C02 e, dessa forma, optou-se por continuar os estudos apenas com ele. Pelo método de exclusão com Azul de Trypan 0,04%, a viabilidade plaquetária após o tratamento com C01 foi de 95,1 ± 0,5%, demonstrando que o composto não foi tóxico para plaquetas humanas. As CI50 do C01 frente à agregação estimulada por ADP, epinefrina e colágeno foram de 20,44 ± 1,21 µM, 64,69 ± 3,32 µM e 67,34 ± 1,45 µM, respectivamente, e a atividade antiagregante não foi tempo-dependente. O teste de hemólise demonstrou que o C01 foi ligeiramente hemolítico (5,1 ± 0,9% de hemólise) em concentrações até cinco vezes superiores à sua CI50. Os perfis das curvas de agregação frente ao ADP indicaram que o composto foi capaz de inibir totalmente a segunda onda de agregação, o que sugere que ele possa interferir com a ativação plaquetária por meio da inibição da via de sinalização do receptor P2Y12. O efeito do C01 sobre a ativação plaquetária foi avaliado por meio da expressão membranar de GpIIb/IIIa ativada (PAC1) e de P-selectina (CD62P) pelo método de citometria de fluxo, e foi verificado que o composto inibiu a expressão de PAC1 (84,4 ± 9,7%) e de CD62P (53,6 ± 7,6%), confirmando a hipótese de que C01 interfere na fase de ativação plaquetária. Para compreender melhor o mecanismo de ação do composto, realizou-se a docagem molecular deste com a enzima PI3K? da via do P2Y12. Verificou-se que o composto não foi capaz de se ligar ao principal aminoácido do sítio ativo da proteína, mas se ligou a outros aminoácidos da região de afinidade. A compilação dos resultados evidencia que o C01 pode ser utilizado como um protótipo no desenvolvimento de novos fármacos antitrombóticos, visto que apresentou significativa atividade antiagregante e não foi tóxico para células humanas.

Abstract: Thrombotic events are a serious global public health problem. Such events can be prevented and treated with antithrombotic drugs; however, these drugs have many limitations and adverse effects. In this context, the search for new agentes with antithrombotic properties in natural products is an area of interest, and the marine environment includes a lot of organisms with bioactive molecules that perform a wide range of pharmacological activities. Therefore, this work aimed to investigate the effect of stypoldione (C01) and fucosterol (C02), derived from the algae Stypopodium zonale and Dictyopteris Jolyana, respectively, on human platelet aggregation and blood coagulation. In silico studies have suggested that both compounds have good oral bioavailability and an appropriate toxicological profile for further in vitro assays. Coagulation activity was assessed by prothrombin time (PT) and activated partial thromboplastin time (aPTT) tests, while the effect on platelet aggregation was evaluated using adenosine diphosphate (ADP), epinephrine and collagen as agonists. Previously to all tests, platelet poor or rich plasma samples were incubated for 5 minutes at 37 °C with the compounds (500 µM) or with 0.5% dimethyl sulfoxide (control). Treatment with C01 significantly prolonged PT (EC50 236.7 ± 1.26 µM), while C02 did not show significant anticoagulant activity. Both compounds significantly inhibited platelet aggregation induced by all tested agonists. C01 presented a more promising antiaggregant activity than C02 and, therefore, it was decided to continue the studies only with the first one. Assessed by the Trypan Blue exclusion method, platelet viability after treatment with C01 was 95.1 ± 0.5%, demonstrating that the compound was not toxic to human platelets. The IC50 of C01 for ADP, epinephrine and collagen-induced aggregation were 20.44 ± 1.21 µM, 64.69 ± 3.32 µM and 67.34 ± 1.45 µM, respectively, and the antiplatelet activity was not time-dependent. The hemolysis test showed that C01 was slightly hemolytic (5.1 ± 0.9% hemolysis) at concentrations up to five times higher than its IC50. The aggregation curve profiles with ADP indicate that the compound is capable of totally inhibiting the second aggregation wave, suggesting that it may interfere with platelet activation by inhibiting the P2Y12 receptor signaling pathway. The effect of C01 on platelet activation was assessed by membrane expression of activated GpIIb/IIIa (PAC-1) and P-selectin (CD62P) by flow cytometry method, and it was found that the compound inhibited PAC-1 (84.4 ± 9.7%) and CD62P expression (53.6 ± 7.6%), confirming the hypothesis that C01 interferes with platelet activation. To better understand the mechanism of action of the compound, it was performed the molecular docking between stypoldione and the enzyme PI3K? from the P2Y12 pathway. It was found that the compound was unable to bind to the major amino acid of the protein active site but bound to other amino acids in the affinity region. Briefly, the compilation of the results shows that stypoldione can be used as a prototype in the development of new antithrombotic drugs, as it showed significant antiplatelet activity and was not toxic to human cells.