Avaliação da atividade antitrombótica do composto menzoquinona isolado da alga parda Desmarestia menziesii

Abstract

Eventos tromboembólicos são responsáveis por uma alta incidência de morbimortalidade em todo o mundo. O tratamento e a prevenção destes eventos envolvem o uso de medicamentos antiagregantes e/ou anticoagulantes. No entanto, os fármacos atualmente disponíveis possuem limitações associadas, como risco aumentado de sangramento e variabilidade interpessoal de resposta, o que limitam o seu uso. Neste contexto, a busca por novas moléculas é crescente e o ambiente marinho, por ser uma fonte rica e ainda pouco explorada de organismos, tem se tornado alvo de pesquisas. O presente estudo teve como objetivo avaliar o efeito do composto menzoquinona, isolado a partir da alga parda Desmarestia menziesii, sobre a agregação plaquetária e a coagulação sanguínea humana. A atividade sobre a coagulação foi avaliada pelos testes de tempo de protrombina (TP) e tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPa). O efeito sobre a agregação plaquetária foi analisado por turbidimetria utilizando difosfato de adenosina (ADP), epinefrina e colágeno como agonistas. A menzoquinona (500 µM) não apresentou atividade anticoagulante significativa. No entanto, inibiu significativamente a agregação plaquetária induzida por todos os agonistas testados, sendo capaz de reverter parcialmente a segunda onda de agregação induzida por ADP e colágeno e parcialmente a primeira onda induzida por epinefrina. Os perfis das curvas de agregação sugerem que o efeito inibitório do composto esteja relacionado a uma inibição de vias de sinalização dependentes da proteína Gi. O efeito antiagregante da menzoquinona é concentração dependente, no entanto, não é dependente do tempo de incubação. As melhores CI50 obtidas foram de 54,8 ± 2,1 µM frente à epinefrina e de 426,9 ± 18,4 µM frente ao colágeno. O efeito do composto menzoquinona sobre a ativação plaquetária foi avaliado por citometria de fluxo por meio da expressão membranar de P-selectina e de GpIIb/IIIa ativada. O composto não foi capaz de inibir a expressão dos marcadores quando avaliado na sua menor CI50 (54,8 µM), no entanto, inibiu em 100% a expressão destes na sua maior concentração (500 µM). O efeito citotóxico da menzoquinona foi avaliado pelo teste de hemólise e pela análise da viabilidade plaquetária pelo método de exclusão por azul de trypan. O composto provocou pequena hemólise em concentrações de até três vezes sua menor CI50 e não foi capaz de reduzir significativamente a viabilidade plaquetária. Estudos in silico foram realizados para predizer a toxicidade, a biodisponibilidade oral e o potencial do composto vir a se tornar um novo fármaco. A predição teórica de toxicidade sugere que o composto apresenta baixo risco toxicológico em todos os parâmetros analisados: mutagenicidade, tumorigenicidade, efeitos irritativos e efeito negativo sobre a reprodução. Os parâmetros preditivos relacionados ao potencial do composto menzoquinona vir a se tornar um fármaco não foram favoráveis, no entanto, são semelhantes ao do antiagregante comercializado ácido acetilsalicílico. Segundo a regra dos cinco de Lipinski, sugere-se que a menzoquinona tem potencial para apresentar boa biodisponibilidade oral. A compilação dos resultados evidencia a potencial utilização do composto menzoquinona como protótipo no desenvolvimento de novos fármacos antitrombóticos.

Abstract: Thromboembolic events are responsible for a high incidence of morbidity and mortality worldwide. The treatment and prevention of these events involve the use of antiplatelet and/or anticoagulant. However, currently available medicines have limitations, such as increased risk of bleeding and interpersonal response variability, which limit their use. In this context, the search for new molecules is growing and the marine environment, for being a rich and still poorly explored source of organisms, has been targeted. The aim of this study was to evaluate the effect of the compound menzoquinone, isolated from the brown algae Desmarestia menziesii, on platelet aggregation and human blood clotting. Coagulation activity was assessed by prothrombin time (PT) and activated partial thromboplastin time (aPTT) tests. The effect on platelet aggregation was analyzed by turbidimetry using adenosine diphosphate (ADP), epinephrine and collagen as agonists. Menzoquinone (500 µM) did not present significant anticoagulant activity. However, it significantly inhibited platelet aggregation induced by all tested agonists, being able to partially reverse the second wave of aggregation induced by ADP and collagen and partially the first wave induced by epinephrine. The aggregation curves profiles suggest that the inhibitory effect of the compound is related to an inhibition of protein Gi-dependent signaling pathways. The antiplatelet effect of menzoquinone was concentration-dependent; however, it was not dependent of the incubation time. The better IC50 obtained was 54.8 ± 2.1 µM when epinephrine as agonist was used, and 426.9 ± 18.4 µM when collagen was used. The menzoquinone effect on platelet activation was assessed by flow cytometry through membrane expression of P-selectine and activated GpIIb/IIIa. The compound was not able to inhibit the P-selectine and GpIIb/IIIa expression when evaluated at its better IC50 (54.8 µM), however, inhibited 100% of their expression at its highest concentration (500 µM). The menzoquinone cytotoxic effect was evaluated by the hemolysis test and by the analysis of platelet viability using the trypan blue exclusion method. The compound caused small hemolysis at concentrations up to three times its better IC50 and do not significantly reduced platelet viability. In silico studies were carried out to predict toxicity, oral bioavailability and the potential of the compound to become a new medicine. The theoretical prediction of toxicity suggests that the compound presents low toxicological risk in all parameters analyzed: mutagenicity, tumorigenicity, irritative effects and negative effect on reproduction. The predictive parameters related to the potential of the compound menzoquinone to become a drug were not favorable, however, it was similar to the antiplatelet medicine aspirin. According to Lipinski's rule of five, it is suggested that menzoquinone has the potential to present good oral bioavailability. The compilation of the results shows the potential use of the compound menzoquinone as a prototype in the development of new antithrombotic drugs.