Avaliação da atividade antimicrobiana de fungos endofíticos isolados de plantas no Brasil contra patógenos humanos

Abstract

A resistência aos antimicrobianos é um dos maiores problemas para saúde pública, por isso muitos estudos se esforçam na busca por novas alternativas de tratamento para infecções causadas por microrganismos resistentes. Fungos endofíticos tem se mostrado como uma abordagem promissora na busca de biomoléculas com potencial antimicrobiano. O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade antimicrobiana de 49 fungos endofíticos isolados de diversas espécies de plantas no Brasil. Inicialmente, uma triagem da atividade foi realizada pelo método de bloco de difusão em ágar e demonstrou que 7 isolados identificados como Penicillium sp. (5 isolados), Aspergillus sp. (1 isolado) e Trichoderma sp. (1 isolado; DR19) exibiram halo de inibição para pelo menos uma das cepas padrão testadas. Buscando a identificação de espécies fúngicas com escassez de dados na literatura com relação à produção de antimicrobianos, foram adicionadas mais 3 amostras de fungos endofíticos no estudo: Paecilomyces sp. (DR26), Alternaria sp. (DR45) e Annulohypoxylon stygium (DR47). Assim, os 4 isolados fungicos DR19, DR26, DR45 e DR47 foram selecionados entre a coleção. Sobrenadantes concentrados de cada cultura líquida fúngica foram testados quanto sua atividade antimicrobiana pelo método de difusão em ágar. O fungo DR47 foi o que apresentou maior potencial de atividade antimicrobiana, apresentando halo de inibição contra duas cepas de Staphylococcus aureus, e contra uma cepa de Candida albicans em todas as condições testadas. Devido ao potencial antimicrobiano apresentado pelo isolado fúngico DR47, um extrato fúngico foi preparado com acetato de etila em um meio de cultivo em estado sólido. Em seguida, o extrato foi testado quanto a sua atividade antimicrobiana, apresentando halo inibitório contra três cepas estafilocócicas e a cepa de C. albicans, além de uma cepa clínica de MRSA. Desta forma, uma análise do genoma do isolado DR47 (A. stygium DR47) foi realizada e possibilitou a identificação de possíveis clusters biossintéticos associados a atividade antimicrobiana. Os resultados obtidos com a análise genômica encontraram porcentagens de similaridade para 15 clusters biossintéticos de moléculas já conhecidas. Entre eles, 6 clusters apresentaram 100% de similaridade. Entre as moléculas codificadas por estes clusters, foram reportados desde compostos utilizados como corante alimentar, por exemplo, a Monascorubrina e também micotoxinas, como a Fusarina. A associação de ferramentas genéticas para exploração in silico e de testes antimicrobianos in vrito possibilitou neste estudo demonstrar que o fungo A. stygium, representa uma nova fonte promissora na busca de compostos contra patógenos humanos, visto que, ele é ainda pouco explorado quanto as suas atividades biológicas. Sendo assim, a identificação de novas moléculas com potencial antimicrobiano pode contribuir, no futuro, na ampliação das opções de tratamentos contra as infecções microbianas, especialmente causadas por microrganismos resistentes, contribuindo para diminuição das taxas de mortalidade e morbidade relacionadas a estes microrganismos.

Abstract: Antimicrobial resistance is a great challenge for public health. Therefore, many studies are striving to find new treatment alternatives for infections caused by resistant microorganisms. Endophytic fungi have been an interesting source in the search for biomolecules showing antimicrobial potential. This study aimed to evaluate the antimicrobial activity of 49 endophytic fungi isolated of plants from Brazil. Initially, the fungi collection was screened using the method of agar block diffusion against standard microbial strains. 7 fungi showed an inhibition halo against at least one of the tested strains. The fungi were identified as Penicillium sp. (5 isolates), Aspergillus sp. (1 isolate) e Trichoderma sp. (1 isolate; DR19). In order to explore fungi genders that are rarely studied as producers of antimicrobial compounds, the isolate of Trichoderma sp. (DR19) from the initial screening and 3 other isolates identified as Paecilomyces sp. (DR26), Alternaria sp. (DR45) and Annulohypoxylon stygium (DR47) were selected among the collection and added to the following studies. Concentrated liquid cultures of the 4 fungi isolates were tested by agar diffusion method. The DR47 isolate presented the most prominent antimicrobial potential, presenting an inhibition halo against two strains of Staphylococcus aureus and one strain of Candida albicans in all tested conditions. Due to the antimicrobial potential presented by the isolate DR47, its fungal extract was obtained from a solid-state culture followed by extraction using ethyl acetate. Subsequently, the extract was tested by agar diffusion method, showing an inhibitory halo against the three staphylococcal strains and the C. albicans strain, as well as a clinical MRSA strain. Thus, an analysis of the whole genome sequencing of the isolate DR47 (A. stygium DR47) was performed and it was possible to identify probable antimicrobial biosynthetic clusters. The results regarding the genomic analysis found percentages of similarity for 15 biosynthetic clusters of molecules already known. Among them, 6 clusters presented 100% of similarity. The compounds codified by those clusters have been reported as food coloring (Monascorubrin) and also as mycotoxins, such as Fusarin. The combination between in silico exploration and in vitro antimicrobial assays made it possible to demonstrate that the fungus A. stygium represents a promising new source in the search for compounds against human microbial pathogens. This fungal specie is still little explored in terms of its biological activities. Thus, the identification of new molecules showing antimicrobial potential may contribute to the expansion of treatment options against microbial infections, especially caused by resistant microorganisms. It will contribute to decrease of the mortality and morbidity rates related to these microorganisms.