Desenvolvimento de um modelo murino de desnutrição infantil e caracterização da disbiose intestinal associada

Abstract

Estima-se que 45% dos óbitos de indivíduos menores de cinco anos de idade se relacionem com a desnutrição. Quadros graves de desnutrição infantil tem como tratamento o uso profilático de Cotrimoxazol, um antimicrobiano de amplo espectro. Apesar do tratamento promover ganho de peso, pouco se sabe sobre o impacto a curto e longo prazo na microbiota intestinal. A microbiota exerce um importante papel na regulação do sistema imunológico. Dessa forma, quadros de disbiose podem acarretar no estabelecimento de doenças crônicas na vida adulta. Para melhor explorar esse fenômeno, desenvolvemos um modelo animal de desnutrição infantil em camundongos C57BL/6 machos e fêmeas. Os animais, com 21 dias de vida, foram submetidos a uma restrição alimentar de 40%, em relação ao consumo normal, por um período de três semanas. Posteriormente o status nutricional foi recuperado com a normalização gradual do volume de ração pelo período de duas semanas. Conforme preconizado pela Organização Mundial da Saúde, os animais desnutridos foram tratados, simultaneamente ao protocolo de desnutrição, com Cotrimaxazol pelo período de duas semanas. Dessa forma, foram criados quatro grupos experimentais: 1. Controle; 2. Desnutrido; 3. Cotrimoxazol; 4. Desnutrido + Cotrimoxazol. A restrição alimentar induziu um tipo de desnutrição aguda e grave nos animais, cujo déficit de peso ficou entre 35 a 44% em relação aos controles. Com a reintrodução gradual da alimentação, este quadro foi revertido e o índice de massa corporal dos animais foi normalizado. A desnutrição também diminuiu o peso do baço (p<0.01) e globulinas no soro (p<0.0001). O uso de Cotrimoxazol não interferiu nos parâmetros morfométricos. A microbiota foi estudada em amostras de fezes coletadas em três tempos experimentais: 1. Anterior; 2. Posterior à desnutrição; e 3. Após a recuperação do status nutricional. Foi realizado o sequenciamento da região V3-V4 do gene 16S RNA. Nos animais controle, foi observado um aumento significativo da diversidade microbiana entre o primeiro tempo experimental e o último (p=0.0078). Apesar disso, o perfil clássico de composição dos filos, com maior representação de Firmicutes e Bacteroidetes, foi mantida durante todos os tempos experimentais. Por outro lado, o protocolo de desnutrição interferiu diretamente nessa proporção, diminuindo Firmicutes, expandindo a de Bacteroidetes. Esse efeito foi ainda maior nos animais tratados somente com Cotrimoxazol. Porém quando o fármaco foi aplicado em animais desnutridos a proporção dos filos aproximou-se do observado no controle. Também foram observadas diferenças entre a composição da microbiota de machos e fêmeas nestas condições. Mais especificamente, enquanto camundongos machos desnutridos ou tratados com Cotrimoxazol apresentaram redução de representantes da família Ruminococcaceae, fêmeas com o mesmo tratamento apresentaram aumento dessa família. A recuperação nutricional, que foi capaz de normalizar a morfometria, não normalizou a composição da microbiota. Machos recuperados da desnutrição tiveram a diminuição de diversos táxons, como do gênero Lactobacillus sp.. Entretanto, animais recuperados da desnutrição e tratados com antimicrobiano tiveram aumento significativo dos filos Actinobacteria, Firmicutes e Proteobacteria em relação aos animais somente desnutridos. Mesmo promovendo o crescimento de diversos filos, a composição da microbiota não foi normalizada nos animais desnutridos e tratados com o fármaco, seu uso resultou num outro perfil de disbiose. Dessa forma, é necessário que intervenções para desnutrição infantil considerem a disbiose da microbiota intestinal.

Abstract: It is estimated that 45% of deaths of individuals under five years of age are related to malnutrition. Severe cases of child malnutrition are treated with the prophylactic use of Cotrimoxazole, a broad-spectrum antimicrobial. Although the treatment promotes weight gain, little is known about the short- and long-term impact on the intestinal microbiota. The microbiota plays an important role in regulating the immune system. Thus, dysbiosis can lead to the establishment of chronic diseases in adulthood. To better explore this phenomenon, we developed an animal model of child malnutrition in male and female C57BL/6 mice. The animals, with 21 days of life, were submitted to a 40% food restriction, in relation to normal consumption, for a period of three weeks. Subsequently, the nutritional status was recovered with the gradual normalization of the volume of feed for a period of two weeks. As recommended by World Health Organization, malnourished animals were treated, simultaneously with the malnutrition protocol, with Cotrimaxazole for a period of two weeks. In this way, four experimental groups were created: 1. Control; 2. Malnourished; 3. Cotrimoxazole; 4. Malnourished + Cotrimoxazole. Food restriction induced a severe acute malnutrition, with weight deficit between 35 and 44% in relation to controls. With the gradual reintroduction of feeding, this situation was reversed and the animals' body mass index was normalized. Malnutrition also decreased the weight of the spleen (p<0.01) and globulins in the serum (p<0.0001). The use of Cotrimoxazole did not interfere with the morphometric parameters. The gut microbiota was analyzed by sequencing the V3-V4 region of the 16S RNA gene extracted from feces, in three experimental points: 1. Before malnutrition; 2. After malnutrition; 3. After the recovery of nutritional status. In the control group, a significant increase in microbial diversity was observed between the first and the last experimental points (p= 0.0078). Despite this, the classic phyla composition profile, with a greater representation of Firmicutes and Bacteroidetes, was maintained throughout the experimental points. On the other hand, the malnutrition protocol directly interfered in this proportion, reducing Firmicutes and expanding Bacteroidetes. This effect was even greater in animals treated with Cotrimoxazole alone. However, when the drug was applied to malnourished animals, the proportion of phyla was similiar with the observed in the control group. Differences were also observed between the composition of the male and female microbiota in these conditions. More specifically, while male malnourished mice or treated with Cotrimoxazole showed a reduction in members of Ruminococcaceae family, females with the same treatment showed an increase in members of this family. Nutritional recovery, which was able to normalize morphometry, did not normalize the composition of the microbiota. Males recovered from malnutrition had a decrease in several taxa, such as the genus Lactobacillus sp. Even thought it promoted the growth of several phyla, the composition of the microbiota was not normalized in malnourished animals treated with the drug, and therefore,it resulted in a different dysbiosis profile, suggesting the need for interventions for child malnutrition that take into account the dysbiosis of the intestinal microbiota.