Resposta celular ao estresse durante a infecção por Flavivirus: causas e consequências

Abstract

O gênero Flavivirus contém os agentes causadores de algumas das doenças arbovirais mais comuns em todo o mundo. No entanto, o desenvolvimento de vacinas e medicamentos específicos para esses vírus continua desafiador, em parte devido à falta de conhecimento de como esses vírus interagem com suas células hospedeiras. O genoma dos flavivírus é um único ssRNA(+) e contém um cap 5 'e uma única fase aberta de leitura que codifica para uma poliproteína. Dada a estrutura do genoma, considera-se que sua tradução ocorre de forma canônica dependente de cap. Apesar disso, uma tradução independente do cap 5? foi relatada, cujo mecanismo ainda permanece controverso. Para entender melhor essa tradução alternativa, começamos investigando qual condição levaria o vírus a uma tradução independente de cap. Uma forma comum de controle sobre a maquinaria de tradução celular é pela fosforilação de eIF2a (p-eIF2a) que promove a interrupção da tradução em resposta a diferentes estressores. Essa resposta é coordenada por quatro quinases que compõem a chamada Resposta Integrada ao Estresse (ISR). Usando células A549 infectadas com DENV4 e ZIKV como modelo, pudemos detectar p-eIF2a após 12 hpi com um pico em 24 hpi e declínio lento depois. Linhagens celulares knockout geradas por CRISPR/Cas9 mostraram que este fenótipo é dependente de PKR, um sensor ISR de dsRNA, e é independente de IFNaI. Outras investigações revelaram que o ZIKV escapa da parada da tradução induzida por p-eIF2a. Surpreendentemente, a replicação de ambos os vírus foi prejudicada nas células PKR-/-. Este prejuízo foi demonstrado pelo título viral e tamanho da placa, mas não pela quantificação do genoma viral. Essa descoberta contraintuitiva indica que esse vírus pode ter cooptado a via PKR-eIF2a para sua replicação. Finalmente, os ensaios com repórteres de luciferase da atividade 5'UTR do ZIKV indicaram que esta região do genoma viral confere uma vantagem translacional quando sob estresse celular. Juntos, esses resultados sugerem a tradução alternativa viral como um mecanismo de evasão que coopta a resposta ao estresse celular para replicação viral ideal. As investigações em andamento visam agora determinar o mecanismo de tradução que ocorre na presença de p-eIF2a.

Abstract: The Flavivirus genus contains the causative agents of some of the most common arboviral diseases worldwide. However, the development of specific vaccines and drugs for these viruses remain challenging partly due to the lack of knowledge of how these viruses interact with their host cells. Flaviviruses?genome is a single ssRNA(+) and contains a 5? cap and a single open reading frame that encodes for a polyprotein. Given the genome structure, its translation is considered to happen by the canonical cap-dependent way. Despite that, a cap-independent translation has been reported, whose mechanism remains controversial. To better understand this elusive alternative translation we started by investigating which condition would drive the virus to a cap-independent translation. A common way of control over the cellular translation machinery is through the phosphorylation of eIF2a (p-eIF2a) that promotes translation arrest in response to different stressors. This response is coordinated by four kinases that compound the so-called Integrated Stress Response (ISR). Using A549 cells infected with DENV4 and ZIKV as a model, we could detect p-eIF2a after 12 hpi with a peak at 24 hpi and slow decline afterwards. CRISPR/Cas9-knockout cell lines showed that this phenotype is dependent on PKR, an ISR sensor of dsRNA, and is independent of IFN-I. Further investigations revealed that ZIKV escapes the translation arrest induced by p-eIF2a. Surprisingly, the replication of both viruses was impaired in PKR-/- cells. This impairment was shown by viral titre and plaque size but not by viral genomic quantification. This counterintuitive finding indicates that this virus may have co-opted the PKR-eIF2a pathway for its replication. Finally, assays with luciferase reporters of ZIKV 5'UTR activity indicated that this region of the viral genome confers a translational advantage under cell stress. Together these results suggest the viral alternative translation as an evasive mechanism that co-opts the cell stress response for optimal viral replication. Ongoing investigations aim now to determine the translation mechanism that takes place in the presence of p-eIF2a.