Criopreservação de sementes e culturas nodulares de Vriesea reitzii Leme & Costa e Vriesea philippocoburgii Wawra: capacidade regenerativa, respostas morfoanatômicas e bioquímicas

Abstract

As bromélias desempenham um importante papel ecológico na manutenção dos ecossistemas. O extrativismo ocasionado pelo seu uso ornamental e a progressiva devastação de seu habitat tem aumentando o número de espécies enquadradas em categorias de ameaça. Entre elas, Vriesea reitzii Leme & Costa e Vriesea philippocoburgii Wawra, ambas epífitas e endêmicas da Mata Atlântica Brasileira. Neste sentido, técnicas de criopreservação representam uma estratégia eficiente para a conservação a longo prazo da diversidade genética destas espécies. Os principais objetivos deste trabalho foram divididos em dois capítulos, sendo: capítulo I: (1) criopreservar cápsulas de V. reitzii e V. philippocoburgii visando eliminar a contaminação durante o estabelecimento in vitro; (2) criopreservar as cápsulas mantendo sua umidade inicial; (3) ilustrar possíveis alterações morfoanatômicas nas sementes decorrentes da criopreservação nestas condições; e (4) comparar as concentrações de poliaminas livres em sementes não criopreservadas e criopreservadas. Capítulo II: (1) desenvolver um protocolo para a criopreservação de culturas nodulares (CNs) de V. reitzii; (2) testar o efeito de diferentes tempos de desidratação em solução de vitrificação (PVS2); (3) avaliar a capacidade das CNs em regenerar microbrotos após a criopreservação; e (4) analisar as características histológicas e ultraestruturais das CNs em diferentes etapas do protocolo proposto. Cápsulas maduras de ambas espécies foram coletas e desinfestadas. Em seguida, foram armazenadas em nitrogênio líquido (+NL) ou em geladeira (-NL). O percentual e o índice de velocidade de germinação foram avaliados durante 21 dias após a inoculação in vitro e o percentual de plântulas normais foi avaliado 60 dias após o cultivo in vitro. CNs induzidas a partir de sementes foram desidratadas por 0, 15, 30, 60 e 90 min. em PVS2 e submetidas ao NL. O percentual de recuperação das CNs após a criopreservação foi avaliado 35 dias após o cultivo in vitro. Aspectos celulares foram analisados em sementes e CNs e as concentrações de poliaminas livres avaliadas nas sementes. Plântulas obtidas a partir da criopreservação das cápsulas não apresentaram contaminação durante o estabelecimento in vitro. Sementes criopreservadas com 29% e 12% de umidade apresentaram maior percentual de germinação, bem como maior índice de velocidade de germinação e maior formação de plântulas normais. Além disso, a criopreservação de sementes com 41 e 55% de umidade acarretou em alterações celulares como plasmólise, intensa vacuolização e descompartimentalização celular. Observou-se concentrações mais elevadas de poliaminas, especialmente putrescina, em sementes criopreservadas. Portanto, essa poliamina pode desempenhar um importante papel na tolerância contra danos decorrentes do congelamento. Na criopreservação de CNs, as maiores taxas de recuperação após o armazenamento em NL foram observados em CNs previamente desidratadas por 15 ou 30 min., 80.0 e 88.7%, respectivamente. CNs desidratadas com PVS2 por 15 min. e cultivadas em meio de cultura suplementado com ANA (2 µM) e BAP (4 µM) foram capazes de regenerar microbrotos após a criopreservação, comprovando a viabilidade do protocolo proposto. Através de análises histológicas e ultraestruturais foram verificadas alterações celulares nos dois tratamentos de PVS2 avaliados (15 e 90 min.). No entanto, a exposição das CNs por 15 min. apresentou menor toxidade, resultando em maiores taxas de recuperação. Este resultado pode estar associado com o maior conteúdo de lipídios e mitocôndrias, bem como grãos de amido e plastoglóbulos nos plastídios, os quais foram observados neste tratamento. A partir dos resultados obtidos, pode-se concluir que a criopreservação de cápsulas, estando as sementes com umidade inferior a 29% (V. reitzii) e com 12% (V. philippocoburgii) é uma estratégia para a conservação destas espécies. Da mesma forma, a criopreservação de CNs de V. reitzii a partir do protocolo de vitrificação proposto mostrou-se eficiente.<br>

Abstract : Bromeliads play an important ecological role in maintaining ecosystems. The extractivism caused by its ornamental use and the progressive devastation of its habitat has increased the number of species framed in categories of threat. Among them, Vriesea reitzii Leme & Costa and Vriesea philippocoburgii Wawra, both epiphytes and endemic to the Brazilian Atlantic Rainforest. In this sense, cryopreservation techniques represent an efficient strategy for the long-term conservation of the genetic diversity of these species. The main objectives of this work were divided into two chapters: Chapter I: (1) cryopreserving capsules of V. reitzii and V. philippocoburgii to eliminate contamination during in vitro establishment; (2) cryopreserving the capsules while maintaining their initial moisture; (3) to illustrate possible morpho-anatomical changes in the seeds resulting from cryopreservation under these conditions; (4) to compare the concentrations of free polyamines in non-cryopreserved and cryopreserved seeds. Chapter II: (1) to develop a protocol for the cryopreservation of nodular cultures (NCs) of V. reitzii; (2) to test the effect of different dehydration times on plant vitrification solution (PVS2); (3) to evaluate the ability of NCs to regenerate microshoots after cryopreservation; (4) to analyze the histological and ultrastructural features of NCs at different stages of the proposed protocol. Mature capsules of the two species were collected and disinfested. They were then stored in liquid nitrogen (+ NL) or in refrigerator (-NL). The germination and the germination speed index were evaluated for 21 days after in vitro inoculation and the percentage of normal seedlings was evaluated 60 days after in vitro culture. NCs induced from seeds were dehydrated for 0, 15, 30, 60 and 90 min. in PVS2 and submitted to NL. The recovery percentage of cryopreserved NCs was evaluated 35 days after in vitro culture. Cellular aspects were analyzed in seeds and NCs and the concentrations of free polyamines evaluated in the seeds. Seedlings obtained from the cryopreservation of the capsules did not present contamination during in vitro establishment. Cryopreserved seeds with 29% and 12% moisture presented higher percentage of germination, as well as higher germination speed index and greater formation of normal seedlings. In addition, cryopreservation of seeds with 41 and 55% moisture resulted in cellular alterations such as plasmolysis, intense vacuolization and cellular decompartmentalization. Higher concentrations of polyamines, especially putrescine, were observed in cryopreserved seeds. Therefore, such polyamine may play an important role in freeze tolerance. In the cryopreservation of NCs, the highest recovery rates were observed in NCs previously dehydrated for 15 or 30 min., 80.0 and 88.7%, respectively. NCs dehydrated with PVS2 for 15 min. and cultured in culture medium supplemented with 2 µM of ANA and 4 µM of BAP were able to regenerate microshoots after cryopreservation, proving the viability of the proposed protocol. Through histological and ultrastructural analysis, it was possible to verify cellular changes in the two PVS2 treatments evaluated (15 and 90 min). However, the NC exposure for 15 min. presented lower toxicity, resulting in higher recovery rates. This result may be associated with higher content of lipids and mitochondria, as well as starch grains and plastoglobuli in plastids, which were observed in this treatment. From the results obtained, it can be concluded that the cryopreservation of capsules, being the seeds with humidity below 29% (V. reitzii) and with 12% (V. philippocoburgii) is a strategy for the conservation of these species. In the same way, the proposed vitrification protocol proved to be efficient for the cryopreservation of NCs of V. reitzii.