Estudo da utilização de nanocarreador para liberação de siRNA para os genes AKT3 e PD-L1 em linhagem celular de câncer mama triplo-negativo

Abstract

Câncer é o termo utilizado para referir-se a um grande grupo de doenças multifatoriais que apresentam descontrole do crescimento e da proliferação celular. Considerando todas as formas de câncer, exceto pele não-melanoma, o câncer de mama é, em nível mundial, o mais incidente no gênero feminino, e o subtipo triplo-negativo, apesar de ser diagnosticado com menor frequência, é de significante relevância médica devido ao prognóstico frequentemente desfavorável e escassez de alternativas terapêuticas eficazes. A utilização de siRNA é uma estratégia que vem apresentando destaque recentemente, sendo baseada na inibição da expressão de proteínas essenciais para desenvolvimento e progressão da doença. Dessa forma, os genes AKT3 e PD-L1 genes foram selecionados com base em revisão da literatura, análise da expressão gênica no subtipo triplo-negativo e sinergismo entre os alvos. AKT3 está relacionado com o crescimento celular e a expressão desta proteína tem sido associada a fenótipos tumorais de maior agressividade. PD-L1, por sua vez, é uma proteína responsável por inibir a resposta imunológica no microambiente tumoral. Entretanto, uma vez que a entrega sistêmica de ácidos nucleicos apresenta diversas barreiras, como o reconhecimento pelo sistema imunológico, baixa estabilidade em ambiente biológico e dificuldade de captação celular, torna-se evidente a necessidade de carreadores que promovam a respectiva entrega efetiva. Neste contexto, o objetivo do presente estudo foi o preparo e a caracterização de duas formulações de nanopartículas híbridas de CaP-PEG-b-poli(GLU)-poliânion, com diferentes concentrações poliméricas, para posterior avaliação da eficácia de entrega de material in vitro. Para tanto, nanopartículas contendo fosfato de cálcio e copolímero foram preparadas a partir da técnica de self-assembly através de mistura estequiométrica simples de soluções aquosas, dando origem a partículas híbridas contendo componentes orgânicos (copolímero e siRNA) e inorgânicos (fosfato de cálcio). Através de medidas de espalhamento dinâmico de luz (DLS), foi possível observar uma distribuição de tamanho estreita para ambas as formulações, sendo que o diâmetro médio foi de 58,3 ± 1,7 e 48,6 ± 0,07, e o índice de polidispersão (PdI), foi de 0,09 ± 0,01 e 0,11 ± 0,01, para os sistemas contendo copolímero nas concentrações de 1000 µg/mL e 750 µg/mL, respectivamente. Os ensaios de estabilidade indicaram que a mudança na concentração de polímero ocasionou redução do período de estabilidade da formulação, em que nanopartículas contendo maior concentração de copolímero mantiveram-se estáveis durante 65 dias em a temperatura controlada de 4ºC, enquanto o sistema contendo menor concentração polimérica apresentou estabilidade de 35 dias em condições semelhantes. Ambas as formulações permaneceram estáveis em temperatura ambiente por um período inferior a 3 dias. Assim, foi possível obter nanocarreadores adequados para aplicações biomédicas a partir de uma técnica simples e de baixo custo, sendo a nanopartícula constituída por polímero na concentração de 1000 ug/ml selecionada para posterior avaliação in vitro.

The term cancer refers to a large group of diseases characterized by abnormal growth and uncontrolled proliferation. Breast cancer (BC) is the most common malignancy worldwide, except for non-melanoma skin cancer. While triple-negative breast cancer (TNBC) is responsible for a minority of BC phenotypes, there is a urgent clinical need for new therapies development, since this subtype shows an aggressive nature and poorer prognosis, with a lack of available treatments. Thus, siRNA application has been considered a promising therapeutic strategy based on specific gene silencing of essential proteins for disease development and progression. With this in mind, AKT3 and PD-L1 genes were selected based on literature review, gene expression analysis in the triple-negative subtype, and synergism between the targets. AKT3 is related to cell growth, and the expression of this protein has been associated with aggressive tumor phenotypes. PD-L1, in turn, is a protein responsible for inhibiting the tumor microenvironment immune response. However, since these nucleic acids need to overcome several barriers for systemic delivery, such as recognition by the immune system, low stability in the biological environment, and difficulty of cellular uptake, the need for carriers that promote their effective delivery becomes evident. In this context, the aim of the present study was to prepare and characterize two CaP-PEG-b-poly(GLU)-polyanion hybrid nanoparticle formulations with different polymer concentrations, aiming further evaluation of the in vitro siRNA delivery efficacy. To this end, nanoparticles containing calcium phosphate and copolymer were prepared using the self-assembly technique through simple stoichiometric mixing of the aqueous solutions, resulting in hybrid particles containing organic (copolymer and siRNA) and inorganic (calcium phosphate) components. Through dynamic light scattering (DLS) measurements, it was possible to observe a narrow size distribution for both formulations, with the average diameter being 58.3 ± 1.7 and 48.6 ± 0.07, and the polydispersity index (PdI), was 0.09 ± 0.01 and 0.11 ± 0.01 for the systems containing copolymer at concentrations of 1000 µg/mL and 750 µg/mL, respectively. The colloidal stability evaluation indicated that polymer concentration change caused a reduction in the stable time of the formulation, where nanoparticles containing a higher concentration of copolymer were stable for 65 days at a controlled temperature of 4°C, while the system containing a lower polymer concentration was stable for only 35 days under similar conditions. Both formulations remained stable at room temperature for a period inferior to 3 days. Thus, it was possible to obtain nanocarriers suitable for biomedical applications from a simple and low-cost technique, and nanoparticles containing polymer at 1000 ug/ml concentration were selected for further in vitro evaluation.