Avaliação da atividade antiagregante de uma série de piranocumarinas e cromenos sintéticos

Abstract

A hemostasia é o recurso biológico responsável pela manutenção do sangue em estado fluído nos vasos sanguíneos em condições fisiológicas. Eventos trombóticos tem impacto direto sobre a morbimortalidade mundial. Antiagregantes e anticoagulantes são essenciais na terapêutica medicamentosa para tratar distúrbios da hemostasia, porém, as terapias convencionais apresentam inúmeros efeitos adversos o que torna seu uso limitado. O desenvolvimento de compostos sintéticos foi um marco na busca por novos fármacos, diante disso, o objetivo geral do presente trabalho foi avaliar a ação de uma série de piranocumarinas e cromenos sintéticos sobre a agregação plaquetária e a coagulação sanguínea humana. Previamente à realização de todos os experimentos, as amostras de plasma pobre ou rico em plaquetas foram incubadas por 5 minutos a 37 °C com os compostos ou com dimetilsulfóxido 0,5% v/v (controle). Os resultados dos ensaios de agregação plaquetária por turbidimetria empregando-se difosfato de adenosina (ADP) e epinefrina como agonistas demonstraram que as duas séries de compostos sintéticos inibiram significativamente a agregação plaquetária estimulada pelos mesmos. A ação dos compostos sobre as vias da coagulação foi elucidada pelos testes de tempo de protrombina (TP) e tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPa). Nenhuma composto causou prolongamento clinicamente significativo do TP e do TTPa. Estudos in sílico demonstraram que piranocumarinas teriam maior probabilidade de desenvolver eventos de toxicidade quando comparadas aos cromenos. Os cromenos SEM 39, 40 e 42 foram selecionados para o prosseguimento dos testes devido à sua similaridade estrutural, bem como, seu efeito promissor sobre a agregação das plaquetas e devido a sua baixa toxicidade teórica. O método de exclusão por azul de Trypan demonstrou que nenhum dos cromenos selecionados diminuiu significativamente a viabilidade das plaquetas. Os três cromenos induziram respostas à agregação dependentes da concentração testada, mas não do tempo de incubação. As CI50 foram determinadas utilizando-se o ADP, a epinefrina e o colágeno como agonistas; as melhores CI50 do SEM 39, 40 e 42 foram obtidas quando as plaquetas foram estimuladas com epinefrina sendo de 94,19 ± 1,47 µM, 61,53 ± 1,80 µM, 110,00 ± 2,07 µM, respectivamente. Os perfis das curvas de agregação sugerem que o provável mecanismo de ação dos três cromenos está relacionado com a inibição da amplificação de sinal pró-agregante (secreção de grânulos ou produção de tromboxano A2 (TxA2). Os três cromenos reduziram de maneira efetiva a ativação plaquetária ao reduzir a expressão de GpIIb/IIIa ativada. Os compostos SEM 40 e 42 não inibiram de forma expressiva a secreção de grânulos a (P-selectina), sugerindo que a inibição da secreção de grânulos não é o principal mecanismo de ação destes compostos. Os três compostos selecionados inibiram significativamente a agregação estimulada por ácido araquidônico, mesmo em uma concentração inferior à sua CI50 (31,2 µM). A compilação de todos os resultados sugere que os cromenos SEM 39, 40 e 42 podem ser utilizados como protótipos para o desenvolvimento de fármacos antiagregantes, uma vez que, não se apresentaram tóxicos para as plaquetas e seu possível mecanismo de ação está relacionado com a inibição da via do TxA2.

Abstract: Hemostasis is the biological resource responsible for maintaining blood in a fluid state in blood vessels under physiological conditions. Thrombotic events have a direct impact on worldwide morbidity and mortality. Antiaggregants and anticoagulants are essential in drug therapy to treat hemostasis disorders, however, conventional therapies have numerous adverse effects, which makes their use limited. The development of synthetic compounds was a milestone in the search for new drugs, therefore, the general objective of this study was to evaluate the action of pyranocoumarins and synthetic chromenes on platelet aggregation and human blood coagulation. Prior to carrying out all experiments, the plasma samples that were poor or rich in platelets were incubated for 5 minutes at 37 °C with the compounds or with 0.5% v/v dimethylsulfoxide (control). The results of platelet aggregation assays by turbidimetry using adenosine diphosphate (ADP) and epinephrine as agonists demonstrated that the two series of synthetic compounds significantly inhibited platelet aggregation stimulated by them. The action of the compounds on the coagulation pathways was elucidated by the prothrombin time (PT) and activated partial thromboplastin time (APTT) tests. No compound caused clinically significant prolongation of PT and APTT. In silico studies have shown that pyranocoumarins are more likely to develop toxicity events when compared to chromenes. Chromene SEM 39, 40 and 42 were selected for further testing due to their structural similarity, as well as their promising effect on platelet aggregation and due to their low theoretical toxicity. The Trypan blue exclusion method demonstrated that none of the selected chromenes significantly decreased platelet viability. The three chromenes induced aggregation responses dependent on the concentration tested, but not on the incubation time. IC50 were determined using ADP, epinephrine and collagen as agonists; the best IC50 of SEM 39, 40 and 42 were obtained when platelets were stimulated with epinephrine being 94.19 ± 1.47 µM, 61.53 ± 1.80 µM, 110.00 ± 2.07 µM, respectively. The profiles of the aggregation curves suggest that the probable mechanism of action of the three chromenes is related to the inhibition of the amplification of the pro-aggregant signal (secretion of granules or production of thromboxane A2 (TxA2). The three chromenes effectively reduced platelet activation by reducing the expression of activated GpIIb/IIIa. Compounds SEM 40 and 42 did not significantly inhibit a granule secretion (P-selectin), suggesting that inhibition of granule secretion is not the main mechanism of action of these compounds. The three selected compounds significantly inhibited arachidonic acid-stimulated aggregation, even at a concentration lower than their IC50 (31.2 µM). The compilation of all the results suggests that the SEM 39, 40 and 42 chromenes can be used as prototypes for anti-aggregating drugs, since they were not toxic to platelets and their possible mechanism of action is related to the inhibition of the blood pathway. TxA2.