Influência da interação da guanosina com os receptores de adenosina A1 e A2a sobre a neuroproteção em um modelo de isquemia cerebral: uma avaliação in vitro e in silico.

Abstract

O nucleosídeo da guanina, a guanosina (GUO), é uma molécula endógena que apresenta efeito neuroprotetor. Em modelos de isquemia cerebral in vitro e in vivo, a GUO previne a redução da viabilidade celular, da captação de glutamato, do potencial de membrana mitocondrial e de muitos outros efeitos deletérios da isquemia. Embora os efeitos neuroprotetores da GUO sejam conhecidos, seus alvos moleculares ainda não foram elucidados. Evidências sugerem que o sistema de transmissão purinérgica medeia os efeitos neuroprotetores da GUO. Os receptores purinérgicos P1, sensíveis à adenosina (AdoR) regulam a vasodilatação, o sistema imune, a liberação de transmissores e diversos outros processos celulares. No sistema nervoso central (SNC) os receptores de adenosina mais expressos são os A1 e A2a. Este trabalho buscou avaliar a relação entre os receptores A1 e A2a e o efeito neuroprotetor da guanosina in vitro. Além disso, analisamos a interação entre a guanosina e os AdoR através de métodos computacionais (in silico). Fatias de hipocampo (400 μm) de ratos Wistar machos (60-90 dias) foram submetidas a 15 minutos de privação de glicose e oxigênio, seguidos de 180 minutos de reoxigenação (PGO/R). Guanosina (100 μM) e/ou DPCPX (antagonista do receptor A1, 100 nM) ou CGS21680 (agonista do receptor A2a, 50 nM) foram adicionados durante o período de reoxigenação. A viabilidade celular foi determinada pela capacidade das células de reduzir brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) e lactato extracelular (meio de incubação) foi mensurado via kit enzimático. Por fim, a interação GUO-AdoR foi avaliada por análises in silico de atracamento molecular. Fatias de hipocampo submetidas à PGO/R sofreram um decréscimo significativo na viabilidade celular e nos níveis de lactato extracelular. O tratamento com GUO preveniu a perda da viabilidade celular e aumentou parcialmente os níveis de lactato extracelular. O antagonista do receptor A1, DPCPX, suprimiu o efeito neuroprotetor da GUO, já CGS21680, um agonista do receptor A2a, apresentou efeitos semelhantes à GUO em relação a esses parâmetros. As análises in silico de atracamento molecular mostraram resíduos de interação da GUO consistentes com os resíduos do sítio ativo dos AdoR, porém valores de energia livre maiores em relação ao seu ligante endógeno, adenosina. Esses achados trazem novos dados sobre a importância do sistema adenosinérgico nos efeitos neuroprotetores da GUO e contribuem para a hipótese de que a sinalização mediada pela guanosina pode ocorrer não na forma monomérica, mas na forma heterodimérica dos receptores A1-A2a.

The guanine nucleoside, guanosine (GUO), is an endogenous molecule showed to have a neuroprotection action. In ischemic stroke, both in vivo and in vitro, GUO prevents reduction of cell viability, glutamate uptake, mitochondrial membrane potential, and many other harmful effects of stroke. Although GUO is known to present neuroprotective effects, its molecular targets are yet to be uncovered. Data suggests that the purinergic system mediates GUO’s protective effects. Purinergic receptors P1 (AdoR), responsive to adenosine, controls vasodilatation, immune system, neurotransmitter release, and a broad specter of cellular process. In the Central Nervous System (CNS), adenosine receptors A1 and A2a (AdoRA1, AdoRA2a, respectively) are the most expressed. This research analyses the relation between AdoRA1 and AdoRA2a and GUO’s in vitro neuroprotective effect. We also analyzed protein- ligand interactions between GUO and AdoR using computational methods (in silico). Hippocampal slices (400 μm) from Male Wistar rats (60-90 days old) were subjected to 15 minutes of oxygen and glucose deprivation (OGD), followed by 180 minutes of reoxygenation (OGD/R). GUO (100 μM) and/or DPCPX (AdoRA1 antagonist, 100nM) or CGS21680 (AdoRA2a agonist, 50 nM) were added during OGD/R. Cell viability was accessed by means of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) reduction. Extracellular lactate levels were accessed by a commercially available kit. Finally, GUO-AdoR protein-ligand interactions were modeled by a molecular docking algorithm. Hippocampal slices subjected to OGD/R had a decrease in cell viability and extracellular lactate levels. GUO treatment prevented the reduction of cell viability and partially prevented the decrease of extracellular lactate levels. AdoRA1 antagonist, DPCPX, blocked GUO’s protective effect while AdoRA2a agonist, CGS21680, mimicked GUO’s effect over these parameters. In silico analysis showed that GUO interacts with consistent residues inside AdoR’s orthosteric site. However, higher levels of free energy, compared to AdoR endogenous agonist, adenosine, were calculated. These data bring light to the role AdoR play in GUO neuroprotective effect and contribute to the hypothesis that GUO does not interact directly with monomeric AdoR but with AdoRA1-AdoRA2a heteroceptor.