Desenvolvimento de formas farmacêuticas sustentáveis com nanoemulsão de macela (Achyrocline satureioides) visando à terapêutica da mastite bovina

Abstract

A mastite é uma doença inflamatória altamente prevalente em bovinos leiteiros, causada na maioria das vezes por bactérias. Dificuldades relacionadas ao tratamento da mastite despertam a necessidade do desenvolvimento de novas estratégias eficazes de controle que possam contemplar os sistemas de produção leiteira convencional, orgânico e agroecológico, colaborando positivamente com questões de saúde pública, saúde humana, saúde animal, qualidade alimentar e ambiental. O presente estudo teve como objetivo o desenvolvimento de formas farmacêuticas antimicrobianas inovadoras, i.e., nanoemulsão de macela (Achyrocline satureioides) e hidrogel a base de mucilegam de linhaça e k-carragenana veículo da nanoemulsão (nanocompósito) visando à terapêutica da mastite bovina. Quatro nanoemulsões de macela desenvolvidas e selecionadas mostraram tamanho médio de partícula entre 203 a 249 nm, distribuição monodispersa (PdI < 0,3), formato esférico e eficiência de encapsulação dos ativos (compostos fenólicos) superior a 94%. A avaliação da atividade antimicrobiana das nanoemulsões de macela (n=4) contra bactérias planctônicas Staphylococcus aureus meticilina-resistente (SARM) mostrou concentrações inibitórias mínimas (CIM50) entre 1,2 a 5% (v/v). Em termos de citotoxicidade, houve redução de 50% de viabilidade (IC50) das células epiteliais mamárias bovinas (linhagem MAC-T) após exposição a concentrações que variaram de 2,6 a 9,7% (v/v) das nanoemulsões de macela (n=4). As concentrações inibitórias mínimas de prevenção da formação de biofilme (CMIB) e de erradicação de biofilmes pré-formados (CMEB) da nanoemulsão de macela mais promissora (NE-ML1:5; 1% de Tween 80 e 5% de óleo de linhaça) foram 25 e 80% (v/v), respectivamente. Na avaliação do tipo de morte celular provocado pela nanoemulsão NE-ML1:5, foi evidenciado efeito citoprotetor sobre as células MAC-T tanto através da prevenção da morte apoptótica (±30%) como necrótica (±40%). A avaliação da capacidade de permeação dos compostos da macela em modelo de células de difusão tipo Franz utilizando explantes da glândula mamária bovina mostrou maior penetração da 3-O metilquercetina e quercetina nanoemulsionados (NE-ML1:5) comparado ao extrato bruto de macela ao longo de 12 h, com um total acumulado de 50 e 111 contra 35 e 48 µg/cm2, respectivamente. Os nanocompósitos (NCs) desenvolvidos à base dos polímeros naturais mucilagem de linhaça e k-carragenana nas proporções 8:2, 7:3 e 5:5 (m/m) com 1,25 mg/g de extrato de macela na nanoemulsão (NE-ML1:5) permitiu o aumento da viscosidade desta formulação. Os três NCs apresentaram características termorreversíveis, com viscosidade similar de 1500 cP em temperaturas entre 40 e 30°C. Os três NCs mostraram perfil de liberação dos fenólicos totais gradativo e sustentado em 72 h, com pico em 24 h (NC-5:5) e 48 h (NCs 7:3 e 8:2). Os NCs 5:5, 7:3 e 8:2 mostraram pico de liberação da 3-O- metilquercetina e da Achyrobichalcona em 72 h. Os três NCs inibiram o crescimento de S. aureus (ATCC 33592) com efeito bactericida até 8 h de incubação. A atividade anti-SARM avaliada por microdiluição em caldo mostrou concentração inibitória mínima (CIM) de 312 µg/mL para o NC-5:5 e de 625 µg/mL para o NC-8:2 e NC-7:3. Não foram encontrados efeitos tóxicos dos compósitos hidrogéis não carregados com a nanoemulsão de macela sobre as células MAC-T. Diante dos resultados obtidos pode-se sugerir que a nanomemulsão de macela e os nanocompósitos desenvolvidos mostraram importantes atividades biológicas, i.e., antimicrobiana, antibiofilme, citoprotetora, maior capacidade de penetração e liberação prolongada dos ativos nas condições in vitro estudadas, viabilizando avaliaçãoes in vivo na terapêutica e prevenção da mastite bovina. Em conjunto, os materiais desenvolvidos representam formas farmacêuticas candidatas para o tratamento da mastite bovina visando reduzir as infecções subclínicas através do uso intramamário. Destaca-se que os materiais inovadores totalmente desenvolvidos a base de produtos naturais podem ainda impactar a saúde, o bem-estar animal e a sustentabilidade da produção leiteira nos diversos sistemas de produção.

Abstract: Mastitis is an inflammatory disease highly prevalent in dairy cattle, most often caused by bacteria. Difficulties related to the treatment of mastitis require the development of new effective control strategies that can contemplate conventional, organic and agroecological dairy production systems, collaborating positively with issues of public health, human health, animal health, food and environmental quality. The aim of this study was to develop innovative antimicrobial pharmaceutical forms, i.e., nanoemulsion and macela-nanocomposite (Achyrocline satureioides) candidates for bovine mastitis treatment. Four macela-nanoemulsions developed showed a mean particle size between 203 to 249 nm, monodisperse distribution (PdI <0.3), spherical shape and encapsulation efficiency values (phenolic compounds) higher than 94%. The antimicrobial activity of macela-nanoemulsions (n=4) against planktonic bacteria methicillin-resistant Staphylococcus aureus (SARM) showed minimum inhibitory concentrations (MIC50) between 1.2 to 5% (v/v). In terms of cytotoxicity, there was a 50% reduction in viability (IC50) of bovine mammary epithelial cells (MAC-T lineage) after exposure to macela-nanoemulsions at concentrations ranging from 2.6 to 9.7% (v/v) (n=4). The minimum inhibitory concentrations for preventing biofilm formation (MBIC) and eradicating preformed biofilms (MBEC) of the most promising macela-nanoemulsion (NE-ML1:5; 1% Tween 80 and 5% linseed oil) were 25 and 80% (v/v), respectively. The type of cell death caused by the NE-ML1:5 nanoemulsion, a cytoprotective effect on MAC-T cells was showed both through the prevention of apoptotic (±30%) and necrotic (±40%) death. The permeation capacity of the compounds of the macela (NE-ML1:5) in a Franz diffusion cell model using bovine mammary gland explants showed greater penetration of nanoemulsified 3-O methylquercetin and quercetin compared to crude extract along 12h, with a final permeated amount of 50.7±3.2 and 111.2±0.6 µg/cm-2 compared to 35.0±0.6 and 48.9±1.2, respectively. The nanocomposites (NCs) developed based on natural polymers, i.e., linseed mucilage and k-carrageenan in the proportions 8:2, 7:3 and 5:5 (w/w) with 1.25 mg/g of macela extract in the nanoemulsion (NE-ML1:5) allowed an increase in the viscosity of this formulation. NCs showed thermoreversible characteristics, with a similar viscosity of 1500 cP at temperatures between 40 and 30°C. NCs showed a gradual and sustained release profile of total phenolics in 72h, with a peak in 24h (NC-5:5) and 48h (NCs 7:3 and 8:2). The NCs 5:5, 7:3 and 8:2 showed a peak release of 3-O-methylquercetin and Achyrobichalcona in 72h. NCs inhibited the growth of S. aureus (ATCC 33592) with a bactericidal effect until 8h. The anti-SARM activity evaluated by broth microdilution showed a minimum inhibitory concentration (MIC) of 312 µg/mL for NC-5:5 and 625 µg/mL for NC-8:2 and NC-7:3. No toxic effects were found for unloaded hydrogel composites on MAC-T cells. The results show that the macela-nanomemulsion and the developed nanocomposites showed important biological activities, i.e., antimicrobial, antibiofilm, cytoprotective, increased permeation and prolonged release of the phenolics in the in vitro studied conditions, allowed in vivo studies in therapy and prevention of bovine mastitis. The materials developed represent candidate pharmaceutical forms for the treatment of bovine mastitis aiming to reduce subclinical infections through intramammary use. It is noteworthy that the innovative materials entirely based on natural products can also impact the health, welfare and the sustainability of dairy production in different production systems.