Caracterização do perfil de transcrição de genes envolvidos na resistência à miltefosina em cepas de Leishmania infantum isoladas de cães naturalmente infectados

Abstract

A leishmaniose visceral é uma doença infecciosa, não contagiosa, causada pelo protozoário Leishmania infantum e está entre as 17 doenças mais negligenciadas no mundo. No Brasil, está em franca expansão e tem os cães domésticos como principais reservatórios do parasito no contexto urbano de transmissão. Assim, o parasito pode acometer cães causando a Leishmaniose Visceral Canina (LVC) e, atualmente, existe no Brasil apenas um medicamento aprovado para o tratamento desses animais, a miltefosina. Existem relatos na literatura sobre alguns genes relacionados ao fenótipo de resistência do parasito à miltefosina, tais como: LiMT, LiRos3, LiABCG4, LiABCG6 e AQP1. Para avaliar a susceptibilidade e o perfil de expressão desses genes em L. infantum, o presente estudo contou com sete isolados de L. infantum, sendo cinco provenientes do município de Florianópolis (SC) e dois provenientes do estado de Minas Gerais (MG). Um total de cinco isolados são provenientes de cães que passaram por tratamento com a miltefosina após diagnóstico de LVC, e três outros são de cães soropositivos que foram submetidos à eutanásia e posterior necrópsia. Todas as cepas tiveram a taxa de infecção individual, a susceptibilidade in vitro à miltefosina e os respectivos valores de IC50 determinados. Além disso, as taxas de expressão relativa ao gene referência SSU foram determinadas para os cinco genes em ensaios de RT-qPCR. Os dados de IC50 aliados com as taxas de infecção, bem como a taxa de amastigotas por macrófago e a taxa de expressão dos genes de interesse mostraram que as cepas provenientes de MG são sensíveis à miltefosina. Em contrapartida, alguns isolados de L. infantum provenientes de cães de Florianópolis (SC) apresentaram perfil de resistência à miltefosina, fato que foi corroborado por análises realizadas após o tratamento dos animais. A quantificação relativa de transcritos dos genes LiMT, LiRos3 e AQP1 apresentou melhor concordância e associação com o fenótipo de resistência observado nos ensaios in vitro de susceptibilidade, seguida pela transcrição do gene LiABCG4. Em contrapartida, a quantificação da expressão do gene LiABCG6 não pôde ser considerada um bom marcador de resistência ou susceptibilidade do parasito. Em suma, os resultados deste estudo chamam a atenção para a importância da avaliação da resistência de populações de L. infantum à miltefosina utilizando-se a RTqPCR dirigida a genes envolvidos na resistência, permitindo o monitoramento da infecção de cães submetidos ao tratamento para LVC com miltefosina.

Abstract: Visceral leishmaniasis is an infectious, non-contagious disease caused by the protozoan Leishmania infantum and is among the 17 most neglected diseases in the world. In Brazil, it is booming and has domestic dogs as the main reservoirs of the parasite in the urban context of transmission. Thus, the parasite can affect dogs causing Canine Visceral Leishmaniasis (CVL) and, currently, there is only one drug approved in Brazil for the treatment of these animals, miltefosine. There are reports in the literature about some genes related to the parasite resistance phenotype to miltefosine, such as: LiMT, LiRos3, LiABCG4, LiABCG6 and AQP1. To assess the susceptibility and expression profile of these genes in L. infantum, the present study included seven isolates of L. infantum, five from the municipality of Florianópolis (SC) and two from the state of Minas Gerais (MG). A total of five isolates come from dogs that underwent treatment with miltefosine after being diagnosed with CVL, and two others are from seropositive dogs that underwent euthanasia and subsequent necropsy. All strains had their individual infection rate, in vitro susceptibility to miltefosine and their IC50 values determined. In addition, expression rates relative to the SSU reference gene were determined for the five genes in RT-qPCR assays. IC50 data combined with infection rates, as well as amastigotes per macrophage rate and the expression rate of genes of interest showed that strains from MG are sensitive to miltefosine. On the other hand, some isolates of L. infantum from dogs in Florianópolis (SC) showed a profile of resistance to miltefosine, a fact that was corroborated by analyzes carried out after the treatment of the animals. The relative quantification of transcripts from the LiMT, LiRos3 and AQP1 genes showed better agreement and association with the resistance phenotype observed in the in vitro susceptibility assays, followed by transcription of the LiABCG4 gene. On the other hand, the quantification of LiABCG6 gene expression could not be considered a good marker of resistance or susceptibility of the parasite. In short, the results of this study draw attention to the importance of evaluating the resistance of L. infantum populations to miltefosine using RT-qPCR directed to genes involved in resistance, allowing the monitoring of infection in dogs undergoing treatment for LVC with miltefosine.