Nanocarreadores de siRNAs como estratégia terapêutica na ceratite amebiana: preparação, caracterização e avaliação da atividade frente a Acanthamoeba castellanii

Abstract

A ceratite amebiana é uma inflamação da córnea, considerada grave e de difícil tratamento, causada por Acanthamoeba spp. As membranas dos trofozoítos e parede dos cistos de Acanthamoeba spp., apresentam componentes essênciais como o ergosterol e celulose. Sendo assim, o objetivo do presente trabalho foi preparar e avaliar nanocarreadores de siRNAs para o silenciamento das enzimas 14 a-demetilase (14alpha) e glicogênio fosforilase (Glico) e seus efeitos sinérgicos em Acanthamoeba castellanii. Como carreadores utilizou-se nanopartículas híbridas (NP) e nanoemulsão lipídica (NE), preparadas e caracterizadas quanto ao tamanho, índice de polidispersão (PdI) e potencial zeta. Para avaliação dos efeitos das formulações em Acanthamoeba spp., trofozoítos foram incubados em meio PYG e em meio de indução de encistamento (NEM) com os nanocarreadores com siRNAs (NP_Glico, NP_14alpha, NE_Glico, NE_14alpha) e na ausência de siRNAs (NK) por contagem em hemocitometro e pelo ensaio de AlamarBlue®. A citotoxicidade das NE foi avaliada pelo ensaio do MTT em células de córnea de coelho (SIRC). O silenciamento gênico foi avaliado por reação em cadeia da polimerase em tempo real após incubação dos trofozoítos em meio NEM por 15 h com as formulações de NE. A microscopia confocal confirmou a capacidade dos sistemas em promover o escape endossomal e entregar os siRNAs. As NE se manteram adequadas para utilização ocular durante os 21 dias analisados, e as NP perderam sua estabilidade com aumento considerável de tamanho e PdI após 7 dias. Ambos os carreadores apresentaram potencial zeta negativo. No tratamento dos trofozoítos com a formulação NP_14alpha não houve diminuição da viabilidade, já NP_Glico ocorreu a queda de 17% em 96 h. Após incubação no meio NEM, NP_14alpha e NP_Glico foram capazes de diminuir 10% dos cistos formados. Na concentração de 1 µM com a NP, observou-se diminuição da formação de cistos maduros em maior porcentagem, porém devido aos precipitados de cálcio visualizados optou-se em parar as análises com este carreador. Quando as nanoemulsões foram incubadas com os trofozoítos, observou-se diminuição das formas de 32% para NK_Glico e NE_Glico, além de 57% e 33% na presença de NK_14alpha e NE_14alpha, respectivamente. Quando tratados com ambos siRNAs (G14), para NK_G14 e NE_G14 apresentaram diminuição da viabilidade dos trofozoítos de 45% e 51%, respectivamente. Após incubação em meio NEM, com NK_Glico e NE_Glico houve queda de 30% e 13% na formação dos cistos, e NE_G14 foi capaz de diminuir 18%. A citotoxicidade em células SIRC manteve-se superior a 90%. Observou-se a redução da expressão dos genes glicogênio fosforilase e 14 a-demetilase de 20% (NE_Glico) e 21% (NE_14alpha) em relação aos controles. A partir dos resultados podese concluir que ambos os nanocarrreadores foram eficientes na entrega de siRNA em A. castellanii. O carreador NE contendo siRNAs para os genes alvos utilizados é promissor para a aplicação na terapia gênica ocular associada a fármacos no tratamento da ceratite amebiana.

Abstract: Amoebic keratitis is a corneal inflammation, considered severe and difficult to treat, caused by Acanthamoeba spp. The trophozoites membranes and the Acanthamoeba spp. cysts walls have essential components such as ergosterol and cellulose. Therefore, the aim of the present work was to prepare and evaluate siRNA nanocarriers for the silencing of 14 a-demethylase (14alpha) and glycogen phosphorylase (Glyco) enzymes and their synergistic effects in Acanthamoeba castellanii. Hybrid nanoparticles (NP) and lipid nanoemulsion (NE) were used as carriers, prepared and characterized in terms of size, polydispersion index (PdI) and zeta potential. To evaluate the effects of the formulations on Acanthamoeba spp., trophozoites were incubated in PYG medium and in encystment induction (NEM) medium with nanocarriers with siRNAs (NP_Glico, NP_14alpha, NE_Glico, NE_14alpha) and in the absence of siRNAs (NK) by counting in a hemocytometer and by the AlamarBlue® assay. The cytotoxicity of NE was evaluated by the rabbit corneal cell MTT assay (SIRC). Gene silencing was evaluated by real-time polymerase chain reaction after trophozoites incubation in NEM medium for 15 h with the NE formulations. Confocal microscopy confirmed the system's ability to promote endosomal escape and deliver siRNAs. NE remained adequate for ocular use during the 21 days analyzed, and NP lost its stability with a considerable increase in size and PdI after 7 days. Both carriers had negative zeta potential. In the treatment of trophozoites with the NP_14alpha formulation, there was no decrease in viability, whereas NP_Glico had a 17% drop in 96 h. After incubation in NEM medium, NP_14alpha and NP_Glico were able to reduce 10% of the cysts formed. At a concentration of 1 µM with NP, there was a decrease in the formation of mature cysts in a greater percentage, however, due to the calcium precipitates seen, it was decided to stop the analysis with this carrier. When the nanoemulsions were incubated with trophozoites, there was a reduction of 32% of forms for NK_Glico and NE_Glico, in addition to 57% and 33% in the presence of NK_14alpha and NE_14alpha, respectively. When treated with both siRNAs (G14), for NK_G14 and NE_G14 they presented decreased trophozoite viability of 45% and 51%, respectively. After incubation in NEM medium, with NK_Glico and NE_Glico, there was a decrease of 30% and 13% in the formation of cysts, and NE_G14 was able to decrease 18%. Cytotoxicity in SIRC cells remained above 90%. There was a reduction in the expression of glycogen phosphorylase and 14 a-demethylase genes of 20% (NE_Glico) and 21% (NE_14alpha) compared to controls. From the results, it can be concluded that both nanocarriers were efficient in delivering siRNA in A. castellanii. The NE carrier containing siRNAs for the target genes used is promising for application in drug-associated ocular gene therapy in the treatment of amoebic keratitis.