Desenvolvimento de nanoemulsão de carvacrol com atividade antimicrobiana

Abstract

Os óleos essenciais (OE) são misturas complexas de substâncias aromáticas voláteis, lipofílicas, resultantes do metabolismo secundário das plantas. Aos OE têm sido atribuídas atividades biológicas, tais como antimicrobiana, antimutagênica, anticarcinogênica e antioxidante. A utilização dos OE representa uma abordagem interessante no controle de organismos patogênicos. A presença dos constituintes majoritários, carvacrol e timol, em OE é reconhecida como marcador de potencial antimicrobiano. Porém, o uso do carvacrol como agente antimicrobiano em produtos com ação germicida é limitado devido a sua elevada volatilidade e baixa solubilidade aquosa. A nanoencapsulação de OE e seus derivados constitui uma estratégia promissora para contornar as limitações de sua utilização na forma in natura. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi desenvolver e avaliar sistemas nanoemulsionados a base de carvacrol, visando a obtenção de um produto com atividade antimicrobiana. Nanoemulsões contendo carvacrol foram preparadas por duas variações da técnica de emulsificação espontânea: deslocamento do solvente e auto-nanoemulsificação (método livre de solvente orgânico). Para otimização das condições de preparação, três parâmetros foram avaliados: concentração de carvacrol, tipo e concentração de surfactante. Os sistemas nanoestruturados contendo carvacrol foram avaliados quanto a citotoxicidade e atividade antimicrobiana in vitro. O potencial desinfetante e/ou antisséptico foi determinado pelo método de diluição/neutralização conforme a Norma Europeia 1040:2005. Soluções alcoólicas de diferentes teores e géis a base do copolímero Aristoflex® AVC contendo carvacrol nanoemulsionado também foram desenvolvidos e avaliados quanto à atividade antimicrobiana. Ambas as técnicas de preparação produziram nanoemulsões monodispersas (PDI < 0,25) com tamanho de partícula médio entre 145 e 315 nm e elevados valores de potencial zeta (acima de -34,1 mV). As formulações permaneceram estáveis por até 90 dias de armazenamento sob diferentes condições de temperatura (8 e 25oC). A nanoemulsão de carvacrol (NC) apresentou concentração inibitória capaz de reduzir a viabilidade celular em 50% (IC50) de 16,12 e 18,78 µg/mL, após 24 e 48 h de incubação em linhagem de fibroblastos 3T3, respectivamente. A concentração inibitória mínima (CIM) da NC contra cepas padrão de S. aureus, S. typhimurium e P. aeruginosa foi de 125, 250 e 500 µg/mL, respectivamente. A NC apresentou ação desinfetante e antisséptica na concentração de 0,8% contra cepas de P. aeruginosa e S. aureus após 5 e 30 min de contato, respectivamente. A associação do etanol à NC demonstrou-se viável, porém não resultou em aumento da atividade antimicrobiana frente as cepas bacterianas avaliadas. O gel contendo carvacrol nanoemulsionado (GNC) apresentou maior ação antimicrobiana contra cepas de S. aureus quando comparado ao S. typhimurium, independente da concentração ou do tempo de incubação testados. A atividade antimicrobiana do GNC frente a S. aureus foi igual ou superior àquela observada para o hipoclorito de sódio 1%, porém, não houve atividade antimicrobiana sobre P. aeruginosa nos tempos testados. O monitoramento da estabilidade das formulações semissólidas contendo carvacrol demonstrou que a nanoencapsulação protege o ativo contra processos de degradação, aumentando tanto a estabilidade do ativo como do produto final. Assim, os resultados obtidos indicam que os sistemas nanoestruturados desenvolvidos representam uma nova estratégia para a liberação do carvacrol, sendo uma alternativa promissora ao desenvolvimento de produtos com finalidade antimicrobiana e desinfetante.<br>

Abstract : Essential oils (OE) are a combination of lipophilics volatile aromatics generated through the plants secondary metabolism. To the OE, it is often attributed biological activities such as antimicrobial, antimutagenic, anticarcinogenic and antioxidant. The use of OE may represent an interesting strategy in controlling pathogens. The presence of the major elements carvacrol and thymol is acknowledged as antimicrobial potential marker. However, the use of carvacrol as antimicrobial agent in germicidal action products is quite limited due to its high volatility and low water solubility resulting in restriction of use. The nanoencapsulation of OE and its derivatives with antimicrobial activity arises as a promising approach to overcome its uses limitations on in natura manners. In this context, the objective of this work is to develop and evaluate nanoemulsified systems based on carvacrol, aiming at obtaining a product with antimicrobial activity. Nanoemulsions were developed using carvacrol through two variations of the spontaneous nanoemulsification method (solvent displacement and organic solvent free/self-nanoemulsitication). In order to optimize the preparation conditions, three parameters were evaluated: carvacrol concentration, type and concentration of surfactant. The nanostructured systems containing carvacrol were evaluated for cytotoxicity and antimicrobial activity in vitro. The disinfectant and/or antiseptic potential were determined by the dilution/neutralization method according to European Standard 1040:2005. Ethanolic solutions and gels based on Aristoflex® AVC copolymer containing nanoemulsified carvacrol were also elaborated and assessed for antimicrobial activity. Both preparation techniques produced monodisperse nanoemulsions (PDI <0.25) with average particle size between 145 and 315 nm and high values of zeta potential (above -34,1 mV). The formulations remained stable for up to 90 days of storage under different temperature conditions (8 e 25oC). The carvacrol nanoemulsion (NC) presented inhibitory concentration capable of reducing cell viability by 50% (IC50) of 16,12 and 18,78 µg/mL after incubation of 24 and 48 hours, respectively, in 3T3 fibroblast lineage. The minimum inhibitory concentration (CIM) of NC against standard strains of S. aureus, S. typhimurium and P. aeruginosa was 125, 250 and 500 µg/mL, respectively. The NC showed disinfectant and antiseptic action at 0.8% concentration against strains of P. aeruginosa and S. aureus after 5 and 30 min of contact, respectively. The association of ethanol with NC was viable, but did not result in an increase in antimicrobial activity against the bacterial strains evaluated. The gel containing nanoemulsified carvacrol (GNC) had a higher antimicrobial action against strains of S. aureus when compared to S. typhimurium, independent of the concentration or incubation time tested. The antimicrobial activity of GNC against S. aureus was equal to or greater than that observed for 1% sodium hypochlorite. No antimicrobial GNC activity was observed on P. aeruginosa. Monitoring the stability of the semi-solid formulations containing carvacrol has demonstrated that nanoencapsulation protects the active against degradation processes, increasing both the stability of the active and the final product. Therefore, the results demonstrate the developed nanostructured systems represent a new strategy to carvacrol release process, appearing as a promising alternative to development of antimicrobial and disinfectant products.