Fisiologia da interação e mecanismos moleculares de resistência da videira (Vitis vinifera) ao Plasmopara viticola (BERK. & M. A. CURTIS) Berl. & De Toni

Abstract

A videira, uma das espécies frutíferas mais cultivadas mundialmente, apresenta suscetibilidade a diversos patógenos, destacando-se como principal causador de danos o míldio, (Plasmopara viticola). Locos de resistência contra este patógeno (Rpv) são descritos para outras espécies do gênero Vitis. Rpvs estão associados ao reconhecimento patogênico, provavelmente via nucleotide-bind Leucine-rich repeat, desencadeando reações celulares de imunidade, Effector-Triggered Immunity (ETI). A cascata de sinais ativada resulta na morte celular, inibindo o progresso do patógeno. Pouco se sabe quanto aos mecanismos moleculares ativados por Rpvs, atuando isoladamente ou piramidados. Portanto, o objetivo com esta tese de doutorado foi caracterizar, a nível celular, as interações entre plantas portadoras de Rpvs e o P. viticola. A tese divide-se em 3 capítulos, no primeiro é apresentado a cinética da expressão gênica para os genes JAZMONATE ZIM DOMAIN 1 (JAZ1) e JAZ3, MYC2, TOPLESS, PATHOGENESIS RELATED-1 (PR1) e PR10, NONEXPRESSOR OF PATHOGENESIS RELATED 1 (NPR1), WRKY70, AtMYB44, STILBENE SYNTHASE (STS), GLICOSILTRANSFERASE (GT) e RESVERATROL O-METHYLTRANSFERASE (ROMT), bem como, dos níveis hormonais para ácido jasmônico (AJ), ácido salicílico (AS), ácido abscísico (ABA), ácido giberélico (GA4), ácido indolacético (AIA), zeatina (Z) e trans-zeatina-ribose (t-Z-R), em genótipos portadores de genes Rpvs expostos ao patógeno. Na avaliação da expressão gênica, foram utilizados genótipos contendo ausência de Rpv (genótipo suscetível), Rpv3-1, Rpv1+Rpv3-1 e Rpv3-3+Rpv10. A quantificação hormonal foi feita nos mesmos genótipos e também no genótipo Rpv3-1+Rpv3-3. No segundo capítulo, é apresentado a expressão diferencial de proteínas, identificadas em culturas celulares, contendo Rpv1+Rpv3-1, Rpv3-1 e rpv (suscetível), expostas ao patógeno. As culturas celulares foram obtidas a partir de calos foliares, mantidos em meio de cultura sólido e inoculados com P viticola, a coleta foi realizada em 24 horas após a inoculação. Os resultados apontam para a resposta de expressão diferencial de proteínas e processos biológicos nas células a partir de genótipos com resistência genética, resultando na indução de estresse oxidativo e morte celular, enquanto que no genótipo suscetível foi verificada maior quantidade de proteínas reguladas negativamente ou silenciadas com a inoculação do patógeno. O terceiro capítulo relata as atividades realizadas durante o período sanduíche na Fondazione Edmund Mach (FEM, Trento-IT). Foi desenvolvido uma avaliação temporal de uma pesquisa de médio prazo com o objetivo de conhecer o perfil metabólico de genótipos de videira contendo diferentes locos de resistência ao P. viticola quando expostos ao referido patógeno em distintos anos. Foram utilizados os genótipos F12P127 (Rpv3-1+Rpv3-3+Rpv10) e F12P60 (Rpv3-1+Rpv12), além das cultivares Bianca (Rpv3-1) Jasmine (Rpv12) BC4 (Rpv1), Solaris (Rpv3-3+Rpv10), pertencentes a coleção de germoplasma da FEM. Foram quantificadas as expressões dos compostos primários, fenólicos, voláteis e lipídicos em 0, 12, 48 e 96 horas posterior a inoculação (hpi). A principal alteração metabólica ocorre nas primeiras horas, principalmente pela sinalização do estresse oxidativo e a indução da morte celular. Com os resultados obtidos nos três capítulos foi possível descrever fisiológica e bioquimicamente a interação da videira e o P. viticola nos níveis de expressão gênica, mudanças no perfil de proteínas e modulação dos compostos metabólicos, durante o processo de interação planta patógeno.

Abstract: Grapevine is one of the most cultivated fruit worldwide; however, it is susceptible to several pathogens, as downy mildew (Plasmopara viticola), which is one of the main grapevine pathogens. Resistance loci (Rpv) against this pathogen have been described for Vitis species. Rpvs are associated with pathogenic recognition, probably via nucleotide-bind Leucine-rich repeat, triggering cellular immune reactions, by Effector-Triggered Immunity (ETI), resulting in cell death, and inhibition of the pathogen's progress. Little is known about the molecular mechanisms activated by Rpvs, acting alone, or pyramided. The aim of the present work was to characterize the interactions between exposed plants carrying Rpvs and P. viticola. The thesis is composed by 3 chapters. In the first one it is presented the kinetics of the gene expression for the genes JAZMONATE ZIM DOMAIN 1 (JAZ1) and JAZ3, MYC2, TOPLESS, PATHOGENESIS RELATED-1 (PR1) and PR10, NONEXPRESSOR OF PATHOGENESIS RELATED 1 (NPR1), WRKY70, AtMYB44, STILBENE SYNTHASE (STS), GLYCOSTRANSFERASE (GT) and RESVERATROL O-METHYLTRANSFERASE (ROMT), as well as hormone levels for jasmonic acid (JA), salicylic acid (SA), abscisic acid (ABA), gibberellic acid (GA4), indoleacetic acid (IAA), zeatin (Z) and trans-zeatin-ribose (tZR), in genotypes with Rpvs exposed to pathogen. For gene expression, genotypes containing Rpv3-1, Rpv1+Rpv3-1 and Rpv3-3+Rpv10 and rpv (susceptible) were used. For hormonal quantification, the genotype Rpv3-1+Rpv3-3 was added. In the second chapter, it is presented the differential expression of proteins, identified in cell cultures, containing Rpv1+Rpv3-1, Rpv3-1 and rpv, exposed to contamination with P. viticola. The cell cultures were obtained from leaf calluses, cultivated in gelled culture medium, and inoculated with P. viticola; the collection being performed 24 hours after inoculation. The results pointed out the differential expression of proteins and biological processes in cells from genotypes with genetic resistance, resulting in the induction of oxidative stress and cell death. In the susceptible genotype, a greater amount of negatively regulated or silenced proteins was observed with the pathogen inoculation. The third chapter reports activities carried out in the sandwich period at the Fondazione Edmund Mach (FEM, Trento-IT). Part of a research was developed with the objective of understand the metabolic profile of grapevine genotypes carrying different Rpv loci against when exposed to P. viticola. The genotypes F12P127 (Rpv3-1+Rpv3-3+Rpv10) and F12P60 (Rpv3-1+Rpv12) were used, in addition to the cultivars Bianca (Rpv3-1), Jasmine (Rpv12), BC4 (Rpv1), and Solaris (Rpv3-3+Rpv10), belonging to the germplasm collection FEM. The expressions of primary, phenolic, volatile and lipid compounds were quantified at 0, 12, 48 and 96 hours post inoculation (hpi). The main metabolic alteration occurs in the first hours, mainly by signaling oxidative stress and inducing cell death. The results obtained allowed the physiological and biochemical characterization of the interaction between grapevine and P. viticola in the levels of gene expression, changes in the protein profile and modulation of the metabolic compounds, during the pathogen plant interaction process.