Mecanismo de ação da 1a,25-dihidroxivitamina D3 na homeostasia da glicose em ilhotas pancreáticas de ratos: estudos in vivo, in vitro e in silico

Abstract

O metabólito ativo da vitamina D3 (1,25-D3) está relacionado a efeitos benéficos no metabolismo da glicose através do aumento da secreção e melhora da sensibilidade à insulina. A enzima ERp57 é descrita por interagir com isômeros da 1,25-D3 (6-s-cis e 6-s-trans) e ativar cascatas de sinalização intracelulares, como a via MAPK/ERK1/2, que contribui para a sobrevida das células ß pancreáticas. Neste trabalho foi estudado o efeito da 1,25-D3 e do colecalciferol na glicemia de ratos normoglicêmicos e resistentes à insulina, bem como, a resposta rápida da 1,25-D3 no influxo de 45Ca2+ e o papel da via MAPK/ERK 1/2 no mecanismo de ação, para secreção de insulina em ilhotas pancreáticas isoladas de ratos. Interações entre isômeros da 1,25-D3 com ERp57, PKCa foram investigadas através de simulações computacionais. In vivo: ratos Wistar em jejum (2 h) foram divididos em cinco grupos experimentais: Controle (NaCl 0,9%), 1,25-D3 (20 µg/ml/ Kg; i.p.), colecalciferol (2.640 UI; 1.8 nM; g.o.), dexametasona (0,1 mg/mL; i.p.), 1,25-D3 + dexametasona e colecalciferol + dexametasona. Os compostos foram administrados durante 5 dias antes de realizar o teste de tolerância à insulina (TTI; 0,2 U/ Kg; i.p.). Após o TTI, foram quantificados glicemia, AST, ALT, ?-GT, LDH, CT, TG, cálcio total e glicogênio hepático. In vitro: após o equilíbrio de 45Ca2+, ilhotas pancreáticas isoladas foram incubadas com ou sem 1,25-D3 (1 nM - 1 min) ou ativador/bloqueador de canais/proteínas. Radioatividade e proteínas foram quantificadas. Insulina estática foi determinada por ELISA. A co-localização de p-ERK1/2, na presença/ausência de PD 98-059, foi investigada por imunofluorescência. In silico: ERp57 (PDB: 3F8U) e PKC (PDB: 3PFQ) foram obtidas por modelo de homologia (SwissModel); os ligantes 6-s-cis (LUM; MarvinSketch; ChemAxon v.20.17; UCSF Chimera) e 6-s-trans (VDX; Dock Prep; UCSF Chimera v. 1.14) foram minimizados. As poses docadas com menor energia de ligação (Autodock Vina; RMSD, 0,0000) foram submetidas as simulações de dinâmica molecular (GROMACS; modelo de água TIP3P; GAFF; 10 ns). Neste trabalho, observamos que in vivo, a 1,25-D3 preveniu a resistência à insulina, no entanto, o colecalciferol não reproduziu efeito semelhante. A 1,25-D3 reduziu o conteúdo de AST e ALT, LDH e CT e aumentou TG e cálcio total. Estudos in vitro mostraram que a 1,25-D3 estimulou fosforilação de MAPK/ERK1/2, influxo de 45Ca2+ e secreção de insulina em ilhotas pancreáticas de ratos. O efeito estimulatório da 1,25-D3 foi inibido por diazoxide, apamina, tapsigargina, dantrolene, 2-APB, nifedipina, TEA, Ro 32-0432, KT-5720; e aumentado pela glibenclamida e Netilmaleimida. In silico, ERp57 ou PKCa tiveram interações energéticas favoráveis com LUM e VDX. A estabilidade dos complexos proteínas-ligantes refletiu-se na menor variação dos valores de RMSD. LUM ou VDX interagiram por ligações de hidrogênio a ERp57 ou a PKCa em uma cavidade hidrofóbica com áreas superficiais relacionadas. De acordo com estes resultados pode-se concluir que o efeito estimulatório da 1,25-D3 nas células ß pancreáticas envolve a ativação dos canais L-VDCC, K+-ATP e K+-Ca2+, que contribuem para a despolarização celular. Essas alterações iônicas também ativam participantes à jusante. Após aumento intracelular abrupto de cálcio e secreção de insulina, a ativação dos canais Kv é crucial para repolarização celular. As predições in silico sugerem que LUM e VDX interagem com ERp57 e PKCa, podendo desencadear e ativar respostas rápidas não genômicas (via MAPK/ERK1/2), que contribuem para sobrevida de células ß pancreáticas de ratos. De modo geral, estes dados apontam que as proteínas estudadas são possíveis alvos terapêuticos, juntamente com o papel da 1,25-D3 como adjuvante em quadros de hiperglicemia.

Abstract: The active metabolite of vitamin D3 (1,25-D3) is related to beneficial effects on glucose metabolism by increasing insulin secretion and improving insulin sensitivity. The enzyme ERp57 is described to interact with isomers of 1,25-D3 (6-s-cis and 6-s-trans) and activate intracellular signaling cascades, as well as, the MAPK/ERK1/2 pathway, which contributes to pancreatic ß cell survival. In this work, the effect of 1,25-D3 and cholecalciferol on glycemia of euglycemic and insulin-resistant rats were studied, as well as, the rapid response of 1,25-D3 in the 45Ca2+ influx and the role of the MAPK/ERK1/2 pathway in its mechanism of action, for insulin secretion in isolated pancreatic islets from rats. Interactions between isomers of 1,25- D3 with ERp57, PKCa were investigated through computational simulations. In vivo: fasting wistar rats (2 h) were divided: Control (NaCl 0.9%), 1.25-D3 (20 µg/ml/ Kg, i.p.), cholecalciferol (2,640 IU; 1.8 nM; o.g.), dexamethasone (0.1 mg/ mL, i.p.), 1.25-D3 + dexamethasone and cholecalciferol + dexamethasone. All compounds were administered during 5 days prior to insulin (0.2 U/ Kg; i.p.). After ITT, glycemia, AST, ALT, ?-GT, LDH, CT, TG, total calcium and hepatic glycogen were quantified. In vitro: after 45Ca2+ equilibrium, isolated pancreatic islets were incubated with/without 1,25-D3 (1 nM - 1 min) or channels/proteins activator/blocker. Radioactivity and proteins were quantified. Static insulin was determined by ELISA. The co-localization of p-ERK1/2, in the presence/absence of PD 98-059, was performed by immunofluorescence. In silico: ERp57 (PDB: 3F8U) and PKC (PDB: 3PFQ) proteins were obtained through homology model (SwissModel); ligands 6-s-cis (LUM; MarvinSketch; ChemAxon v.20.17; UCSF Chimera) and 6-s-trans (VDX; Dock Prep; UCSF Chimera v. 1.14) were minimized. The docked poses with lower binding energy (Autodock Vina; RMSD, 0.0000) were subjected to molecular dynamics simulations (GROMACS; TIP3P water model; GAFF; 10 ns). 1,25-D3 in vivo prevented insulin resistance, however, cholecalciferol did not reproduce similar effect. 1,25-D3 in vivo decreased serum concentrations of AST and ALT (suggestive of liver protection), LDH and TC and increased TG and total calcium. In vitro, 1,25-D3 stimulated MAPK/ERK1/2 phosphorylation, 45Ca2+ influx and insulin secretion in rat pancreatic islets. The stimulatory effect of 1,25-D3 was inhibited by diazoxide, apamine, tapsigargine, dantrolene, 2-APB, nifedipine, TEA, Ro 32- 0432, KT-5720; and increased by glibenclamide and N-ethylmaleimide. In silico, ERp57 or PKC had favorable energetic interactions with LUM and VDX. Proteins-ligands complexes stability was reflected in the lower variation on RMSD values. LUM or VDX interacted by hydrogen bonds with ERp57 or PKC in a hydrophobic pocket with related surface areas. The stimulatory effect of 1,25-D3 on pancreatic ß cells involves the activation of L-VDCC, K+-ATP and K+-Ca2+ channels, which contributes to cellular depolarization. These ionic changes also activate downstream participant?s. After an abrupt intracellular calcium increase and insulin secretion, the activation of Kv channels may be crucial for cell repolarization. In silico predictions suggest that LUM and VDX interact with ERp57 and PKC, thus triggering and activating rapid non-genomic responses (MAPK/ERK1/2 pathway), contributing to the pancreatic ß cells survival of rats. Altogether, these data point out that the studied proteins are possible therapeutic targets, together with the role of 1,25-D3 as an adjuvant in hyperglycemia.