Padronização de biomarcadores para avaliação prognóstica e investigação de células do sistema imune intratumorais no câncer de boca por citometria de fluxo

Abstract

O câncer de boca é definido como o conjunto de neoplasias malignas que acometem os lábios, a cavidade oral e a orofaringe e destaca-se pelas suas altas taxas de incidência e mortalidade. Embora o diagnóstico do câncer de boca seja realizado pela análise morfológica, a investigação fenotípica desses tumores pode fornecer dados prognósticos valiosos. Todavia, a imunohistoquímica como ferramenta adicional apresenta diversas limitações técnicas. Nesse sentido, acredita-se que a utilização da análise multiparamétrica por citometria de fluxo pode oferecer excelentes possibilidades para a avaliação de marcadores de prognóstico do câncer de boca. Assim, o objetivo deste trabalho foi validar a imunofenotipagem por citometria de fluxo, como metodologia complementar para a avaliação de marcadores de prognóstico de tumores sólidos de origem epitelial de boca. Precedendo a padronização da citometria de fluxo, constatou-se a necessidade de se conhecer o perfil epidemiológico da população atendida no Hospital Universitário (HU/UFSC/EBSERH). No período de 2013 a 2018 foram diagnosticadas na Unidade de Laboratório de Anatomia Patológica do HU/UFSC/EBSERH 332 neoplasias de boca, dessas, 87,65% foram carcinomas de células escamosas. As regiões anatômicas mais acometidas foram os lábios, seguidos pela língua, amígdala e base de língua. A maioria dos tumores labiais foi diagnosticada em estadios iniciais (I e II), e aproximadamente metade dos tumores de cavidade oral e orofaringe foram diagnosticados em estadios tardios (III e IV), que geralmente estão associados a um mau prognóstico. Considerando a prevalência e a gravidade do câncer de boca na população estudada, considerou-se relevante a validação de uma nova metodologia para avaliação desses tumores. Para isso, 40 amostras de biópsia orais com suspeita de câncer de boca foram desagregadas para obtenção de uma suspensão celular e marcadas com os anticorpos pancitoqueratina, anti-p53, anti-p16. Os resultados obtidos foram comparados com a imunohistoquímica (padrão-ouro). Adicionalmente, foram avaliados o perfil inflamatório das amostras de boca e sua correlação com características clínicas e patológicas. A comparação entre os métodos para avaliação do p16 gerou valores de 81,8% de sensibilidade, 54,5% de especificidade, 64,3% de valor preditivo positivo (VPP) e 75% de valor preditivo negativo (VPN). A concordância entre os testes foi considerada ?razoável? (kappa = 0,364). A avaliação de p53 gerou valores de 100% de sensibilidade, 33,3% de especificidade, 90,5% de VPP e 100 % de VPN. A concordância entre os testes foi considerada ?moderada? (kappa = 0,463). A análise do marcador de proliferação celular Ki-67 por citometria de fluxo mostrou-se equivalente à imuno-histoquímica, com a vantagem de não apresentar viés observacional. A análise dos infiltrados imunes intratumorais mostrou-se plenamente factível com o auxílio da citometria de fluxo. Foram observadas correlações entre a presença de macrófagos, linfócitos B e linfócitos T CD4 e o grau de diferenciação dos tumores. Os resultados deste estudo mostram que a citometria de fluxo é capaz de detectar marcadores prognósticos de câncer de boca, e a sua utilização em conjunto com a análise morfológica e imuno-histoquímica pode fornecer dados importantes tanto no estudo clínico de tumores sólidos, como na avaliação prognóstica de pacientes com câncer de boca.

Abstract: Oral cancer is defined as a group of neoplasms that affect the lips, oral cavity and oropharynx and stands out due to its high incidence and mortality rates. Although the diagnosis of oral cancer is well established by morphological analysis, the phenotypic investigation of these tumors can provide valuable prognostic data. However, immunohistochemistry as an additional tool has several technical limitations, in this sense it is believed that the use of multiparametric analysis by flow cytometry can offer excellent possibilities for the prognostic markers assessment of oral cancer. Thus, the objective of this study was to validate flow cytometry immunophenotyping as a complementary methodology for the evaluation of prognostic markers of solid tumors of oral epithelial origin. Preceding the standardization of flow cytometry it was necessary to determine the epidemiological profile of the population attended at the University Hospital (HU/UFSC/EBSERH). From 2013 to 2018, 332 oral neoplasms were diagnosed at the Pathological Anatomy Laboratory Unit of the HU/UFSC/EBSERH, of which 87.65% were squamous cell carcinomas. The anatomical regions most affected were the lips, followed by the tongue, tonsils and base of tongue. Most labial tumors were diagnosed at early stages (I and II), and approximately half of oral cavity and oropharyngeal tumors were diagnosed at late stages (III and IV), which are generally associated with a poor prognosis. Considering the prevalence and severity of oral cancer in the studied population, the validation of a new methodology for evaluating these tumors was considered relevant. For this, 40 oral biopsy samples with suspected oral cancer were disaggregated to obtain a cell suspension and labeled with pan-cytokeratin, antip53, anti-p16 antibodies. The results obtained were compared with immunohistochemistry (gold standard). Additionally, we evaluated the inflammatory profile of the oral samples and its correlation with clinical and pathological characteristics. The method?s comparison for p16 assessment yielded values of 81.8% sensitivity, 54.5% specificity, 64.3% positive predictive value (PPV) and 75% negative predictive value (NPV). Agreement test was considered ?reasonable? (kappa = 0.364). The p53 analysis yielded values of 100% sensitivity, 33.3% specificity, 90.5% PPV and 100% NPV. Agreement test was considered ?moderate? (kappa = 0.463). The analysis of the proliferation marker Ki-67 by flow cytometry proved to be equivalent to immunohistochemistry with the advantage of being free from observational bias. The analysis of intratumoral immune infiltrates proved to be feasible using flow cytometry. Correlations were observed between macrophages, B lymphocytes and CD4 T lymphocytes and tumor differentiation grade. These results show that flow cytometry is capable of detecting oral cancer prognostic markers, and its use in association with morphological and immunohistochemical analysis can provide important data both in the clinical study of solid tumors and in the prognostic evaluation of patients with oral cancer.