Antineoplastic drugs: effect of doxorubicin on enriched archaea culture from anaerobic digestion and potential degradation via an enzymatic process

Abstract

Fármacos antineoplásicos vem sendo detectados em efluentes e águas superficiais. Devido a sua toxicidade, estes fármacos apresentam grande risco ao meio ambiente, mesmo em baixas concentrações. Sabe-se que estes não são removidos completamente pelo sistema convencional de tratamento de efluentes. Deste modo, o desenvolvimento de novas estratégias para a sua remoção são cruciais. Enzimas como a lacase apresentam grande potencial para degradar diversos poluentes, devido a não especificidade pelo substrato. Além disso, os produtos de degradação gerados por uma degradação enzimática apresentam menor toxicidade em comparação com as moléculas originais. Também não se sabe ao certo como estes fármacos influenciam a comunidade microbiana presente em uma estação de tratamento de efluentes. Alguns grupos de microrganismos representam papel chave no tratamento de efluentes. Por exemplo, as arqueas metanogênicas (que compõem a última etapa da digestão anaeróbica), se estas forem inibidas o processo com um todo será comprometido. Neste sentido, este trabalho tem como objetivo estudar o potencial efeito inibitório do fármaco antineoplásico doxorubicina em arqueas metanogênicas, assim como avaliar o potencial de aplicação da lacase na degradação destes fármacos. Para isso, o efeito inibitório da doxorrubicina sobre a produção de biogás foi avaliado em ensaios de exposição em batelada e em longo prazo. Nos ensaios em batelada, o valor de IC50 de 648 ± 50 µg?L-1 foi obtido para a doxorrubicina. Além disso, verificou-se que a inibição causada pela exposição a 10 × 103 µg?L-1 foi reversível após subsequentes bateladas sem a presença do fármaco no meio e alimentação. A doxorrubicina foi rapidamente adsorvida pela biomassa (apesar do baixo KOW), o que pode ter contribuído para o efeito inibitório sobre os microrganismos. Os resultados dos ensaios de exposição de longo prazo mostraram que quando a quantidade do fármaco foi aumentada de 100 µg?L-1?dia-1 para 200 µg?L-1?dia-1, a produção de biogás e a remoção da carga orgânica diminuíram drasticamente. No entanto, as archaeas metanogênicas foram capazes de se adaptar à condição inibitória, corroborando os resultados encontrados nos ensaios em bateladas sequenciais. Em suma, a doxorrubicina pode desempenhar um papel fundamental na inibição de processos de tratamento biológico de efluentes, se sua concentração em estações de tratamento aumentarem abruptamente. Os ensaios de exposição à doxorrubicina mostraram que esta pode inibir a velocidade de produção de biogás. Desta forma, decidiu-se estudar a degradação desse fármaco por via enzimática. A lacase proveniente de Trametes versicolor foi utilizada para realização dos estudos cinéticos de degradação. A citotoxicidade do fármaco degradado pela lacase foi avaliada e comparada com a doxorrubicina in natura. As melhores condições de degradação foram em pH 7 e em 30ºC, o que se assemelha a parâmetros operacionais de estações de tratamento de efluentes. Os parâmetros cinéticos de Michaelis?Menten foram v_max de 769,2 µg?h-1?L-1 e KM de 4,60 µM indicando uma boa afinidade pelo substrato. Já os ensaios de citotoxicidade demostraram que a lacase reduziu a toxicidade da doxorrubicina, após degradação, apresentando potencial para aplicação na degradação de fármacos antineoplásicos presentes em efluentes, o que abre novos horizontes para estudos sobre o tema.

Abstract: Antineoplastic drugs have been detected in effluents and surface waters. Due to their toxicity, these drugs present a high risk to the environment, even at low concentrations. In addition, it is known that the conventional wastewater treatment system does not completely remove these drugs. Thus, it is crucial the development of new strategies for their removal. Enzymes such as laccase have a great potential to degrade several pollutants due to their non-specificity for the substrate. Besides, the degradation products generated by an enzymatic degradation show less toxicity compared with the original molecule. Furthermore, it is unknown how these drugs influence the microbial community from a wastewater treatment plant. Some groups of microorganisms play a key role in effluent treatment. For example, the whole process will be compromised if microorganisms such as methanogenic archaea are inhibited (which constitutes the last step of anaerobic digestion). In this sense, the main objective of this thesis is to study the inhibitory effect of the antineoplastic drugs doxorubicin on methanogenic archaeas and evaluate the potential application of enzymes (more specifically laccase) in the degradation of these drugs. For this, the inhibitory effect of doxorubicin on biogas production was evaluated in batch and long-term exposure assays. An IC50 value of 648 ± 50 µg?L-1 was obtained for doxorubicin in batch assays. Besides, it was found that the inhibition caused by exposure to 10×103 µg?L-1 was reversible after subsequent batches without the drug in the synthetic medium. Doxorubicin was rapidly adsorbed by biomass (despite the low KOW value), which may have contributed to the inhibitory effect on microorganisms. The long-term exposure assays showed that when the amount of drug was increased from 100 µg?L-1?day-1 to 200µg?L-1?day-1, the biogas production and COD removal drastically decreased. However, the methanogenic archaeas were able to adapt to the inhibitory condition, corroborating the results found in the sequential batch tests. In summary, doxorubicin can play a key role in inhibiting biological processes if its concentration in wastewater treatment plants increases abruptly. Doxorubicin exposure trials have shown that it can inhibit the biogas production rate. Therefore, it was decided to study the enzymatic degradation of this drug. The laccase from Trametes versicolor was used to carry out the kinetic degradation studies. The cytotoxicity of the degraded doxorubicin (by laccase) was evaluated and compared to doxorubicin. The best degradation conditions were at pH 7 and 30ºC, which resembles effluent characteristics from wastewater treatment plants. The Michaelis?Menten kinetic parameters were Vmax of 769.2 µg?h-1?L-1 and KM of 4.60 µM, which showed a good affinity for the substrate. Cytotoxicity showed that laccase reduces the toxicity of doxorubicin after degradation. Laccase presents potential for application for degradation of effluents that contain antineoplastic drugs opens new directions for studies on the subject.