3LBNC Platform: an innovative stacked-­multilayered BNC scaffold for studies of multi­-cell co-­culture in compartmentalization

Abstract

Os modelos de cultivo celular em 3D são largamente estudados na literatura pois muitos trabalhos provaram que células cultivadas em placas (ambiente 2D) diferem do observado in vivo. Consequentemente, diferentes modelos 3D tem sido propostos, mas apresentam importantes desvantagens, como a falta de co-cultura de mais de 2 tipos celulares, a ausência de suporte celular como promovido pela ECM in vivo e ausência de análises de biologia molecular. Neste trabalho, relatamos a produção, caracterização e validação de um arcabouço à base de nanocelulose bacteriana empilhado em multicamadas que possui um formato óptico translúcido. A plataforma foi feita através do cultivo estático de K. hansenii ATCC 23769 em meio DMCM e adição de meio em tempos definidos. A estrutura formada apresentou camadas de BNC conectadas por regiões de menor densidade de nanofibras (câmaras). O tamanho dos poros das camadas e das câmaras foram significativamente distintos e permitiram a co-cultura de linhagem celular de câncer de mama triplo negativo (MDA-MB-231) e de duas células associadas ao tumor (BC-CAFs e macrófagos do tipo M2). As células permaneceram viáveis e com atividade metabólica durante todo o período de análise (até 15 dias). A microscopia confocal não mostrou características de invasão celular, embora as células BC-CAFs e MDA-MB-231 tenham sido frequentemente observadas na mesma região devido a limitações do nosso sistema. A expressão gênica de três importantes genes do BC (Junb, E-cad e DUSP5) foi avaliada e apresentou padrões semelhantes ao descrito in vivo, mas esta análise requer aprimoramento para futuras aplicações. É a primeira vez que essas plataformas BNC multicompartimentadas puras e translúcidas foram propostas e validadas in vitro. Além disso, é a primeira vez que um modelo de co-cultura triplo é proposto em hidrogeis, abrindo possibilidades de aplicabilidade em diversos estudos de sinalização celular parácrina.

Abstract: Cell culture 3D models are a well-established field since many works had proved that cells cultured in plates (2D environment) differ from what is seen in vivo. Consequently, different 3D models have been proposed but they have important drawbacks such as the lack of more than 2 cell types co-culturing, and the absence of cell support as promoted in vivo by ECM and of molecular biology analysis. In this work, we report the production, characterization, and validation of a pristine stacked-multilayered nanocellulose-based scaffold that has an optical translucid format. The platform was made by statically culturing K. hansenii ATCC 23769 in DMCM media and adding further media in defined time-points. The formed structure presented layers of BNC connected by regions of the lower density of nanofibers (interlayers). The pore size of layers and interlayers were significantly distinct and allowed co-culture of the triple-negative breast cancer cell line (MDA-MB-231) and two tumor-associated cells (BC-CAFs and M2 macrophages). Cells remained viable and metabolic activity during the whole period of analysis (up to 15 days). Confocal microscopy showed no characteristics of cell invasion, although BC-CAFs and MDA-MB-231 cells were frequently seen in the same region due to limitations of our system. The gene expression of three important BC genes (Junb, E-cad, and DUSP5) was evaluated and showed similar patterns to what is described in vivo but this analysis requires improvement for further applications. It is the first time that those pristine and translucent multi-compartmentalized BNC platforms were proposed and validated in vitro. Additionally, it is the first time that a triple and independent co-culture model is proposed in hydrogels, opening possibilities of applicability in several studies of paracrine cell signaling.