Atividade antitumoral de imidazo[1,2-a]piridinas seleniladas: danos oxidativos, modulação da via da Akt/mTOR, inibição de NLRP3 e ativação da apoptose

Abstract

O carcinoma hepatocelular (CHC) e o glioblastoma (GBM) caracterizam-se pela agressividade relacionada a alterações bioquímicas nos mecanismos de diferenciação, proliferação e morte celular. A busca por moléculas que possam atuar de forma efetiva e seletiva no tratamento desses tumores é relevante para a clínica médica. Compostos organoselênio e derivados de imidazopiridinas são amplamente utilizados na química medicinal e no desenvolvimento de fármacos. O principal objetivo deste estudo foi avaliar o potencial antitumoral in vitro, in vivo e in silico de derivados de imidazo[1,2-a]piridinas seleniladas. Derivados de imidazo[1,2-a]piridinas (0-1000 µM, 72 h) foram testados quanto à citotoxicidade (MTT) e seletividade em linhagens tumorais (HepG-2 e A172) e não tumorais (McCoy e HT-22). Os compostos IP-Se-05 e IP-Se-06 apresentaram maior citotoxicidade e seletividade para HepG-2 com CI50 de 0,85 µM e 0,03 µM respectivamente, sendo selecionados para os ensaios posteriores. O ensaio clonogênico demonstrou efeito antiproliferativo do composto IP-Se-06 (p<0,01) que foi confirmado pela redução dos níveis de Akt, ERK1 e ERK2, e proteínas envolvidas na progressão do ciclo celular ciclina B1 e CDK2. IP-Se-06 induziu a parada do ciclo celular em G1 (p<0,05) além de significativa diminuição do número de células na fase S (p<0,01) e G2/M (p<0,05). O composto IP-Se-05 aumentou significativamente a necrose celular (p<0,01), enquanto IP-Se-06 causou um aumento significativo da morte por apoptose (p<0,01) com aumento dos níveis de p53 e diminuição de Bcl-xL. IP-Se-06 ocasionou aumento significativo nos níveis de EROs (p<0,01), ocasionando a fragmentação do DNA (p<0,001) e aumento dos níveis da ?-H2AX. Além disso, o composto IP-Se-05 diminuiu os níveis da TrxR (p<0,01) e GPx (p<0,001). Já o composto IP-Se-06 foi capaz de diminuir o conteúdo de GSH (p<0,05) e a atividade da GR (p,0<0,05), GPx (p<0,001), CAT (p<0,01) e TrxR (p<0,001). Assim, ambos os compostos se apresentam como compostos líderes para o desenvolvimento de novos antitumorais para o tratamento de hepatocarcinoma. Em células A172, IP-Se-06 apresentou maior citotoxicidade (CI50 de 1,78 µM) e seletividade. IP-Se-06 ocasionou redução dos níveis de GSH (p<0,05) e atividade TrxR (p<0,05), e a diminuição dos níveis de NRF2. O composto induziu a despolarização de membrana mitocondrial (p<0,001) e liberação de citocromo c para o citosol. A condensação da cromatina foi confirmada pelo aumento da fluorescência com DAPI e o dano ao DNA confirmado pelo aumento nos níveis de ?-H2AX. IP-Se-06 induziu a morte celular por apoptose (p<0,01), confirmada com a diminuição dos níveis de Bcl-xL e aumento de p53. A parada do ciclo celular em G1 (p<0,05) por IP-Se-06 corroborou com a diminuição dos níveis de proteínas envolvidas na via Akt/mTOR e diminuição de HIF-1a. O ensaio clonogênico demonstrou significativo efeito antiproliferativo de IP-Se-06 (p<0,001). Além disso, a presença do inibidor de MEK (U0126) causou um efeito sinérgico em células expostas também ao IP-Se-06 ocasionando uma redução significativa no número de colônias. A inibição da via MEK por IP-Se-06 foi comprovada pela diminuição dos níveis de ERK 1/2. Ainda, IP-Se-06 diminuiu os níveis de p-p38, NLRP3 e caspase-1, reduzindo a resposta inflamatória desencadeada pelo complexo inflamassoma. Os resultados in vivo (tumor ascítico de Ehrlich) demonstraram inibição do crescimento tumoral (42%), aumento na sobrevida dos animais (49,43%) e diminuição da angiogênese (p<0,05) nos animais tratados com o composto IP-Se-06 na concentração de 1mg/kg. Foi observado que o composto IP-Se-06 não foi capaz de alterar os níveis plasmáticos de glicose quando comparado ao controle. Por fim, as predições previstas no ADMET em conjunto com os resultados obtidos até o momento apontam IP-Se-06 como promissor composto líder para o desenvolvimento de um possível fármaco antitumoral; no entanto, destaca-se a necessidade de futuras modificações estruturais.

Abstract: The hepatocellular carcinoma (HCC) and glioblastoma (GBM) are characterized by aggressiveness related to biochemical changes in differentiation mechanisms proliferation and cell death. The search for molecules that can act effectively and selectively in the treatment of these tumors it is relevant to clinical medicine. Organoselenium compounds and imidazopyridine derivatives are widely used in medicinal chemistry and drug development. The main objective of this study was to evaluate the in vitro, in vivo and in silico antitumor potential of selenylated imidazo[1,2-a]pyridine derivatives. Imidazo[1,2-a]pyridine derivatives (0-1000 µM, 72 h) were tested for cytotoxicity (MTT) and selectivity in tumor (HepG-2 and A172) and non-tumor (McCoy and HT-22) lines. The compounds IP-Se-05 and IP-Se-06 showed greater cytotoxicity and selectivity for HepG-2 with IC50 of 0.85 µM and 0.03 µM respectively, being selected for further assays. The clonogenic assay demonstrated an antiproliferative effect of the compound IP-Se-06 (p<0.01) which was confirmed by the reduction in the levels of Akt, ERK1 and ERK2, and proteins involved in the progression of the cyclin B1 and CDK2 cell cycle. IP-Se-06 induced cell cycle arrest in G1 (p<0.05) in addition to a significant decrease in the number of cells in phase S (p<0.01) and G2/M (p<0.05). The compound IP-Se-05 significantly increased cell necrosis (p<0.01), while IP-Se-06 caused a significant increase in death by apoptosis (p<0.01) with increasing p53 levels and decreasing Bcl-xL. IP-Se-06 caused a significant increase in ROS levels (p<0.01), causing DNA fragmentation (p<0.001) and increased ?-H2AX levels. Furthermore, the compound IP-Se-05 decreased the levels of TrxR (p<0.01) and GPx (p<0.001). The compound IP-Se-06 was able to decrease the content of GSH (p<0.05) and the activity of GR (p<0.05), GPx (p<0.001), CAT (p<0 .01) and TrxR (p<0.001). Thus, both compounds are presented as leading compounds for the development of new antitumor drugs for the treatment of HCC. In A172 cells, IP-Se-06 showed greater cytotoxicity (IC50 of 1.78 µM) and selectivity. IP-Se-06 caused a reduction in GSH levels (p<0.05) and TrxR activity (p<0.05), and a decrease in NRF2 levels. The compound induced mitochondrial membrane depolarization (p<0.001) and release of cytochrome c into the cytosol. Chromatin condensation was confirmed by increased fluorescence with DAPI and DNA damage was confirmed by increased ?-H2AX levels. IP-Se-06 induced cell death by apoptosis (p<0.01), confirmed by a decrease in Bcl-xL levels and an increase in p53. The arrest of the cell cycle in G1 (p<0.05) by IP-Se-06 corroborated with a decrease in the levels of proteins involved in the Akt/mTOR pathway and a decrease in HIF-1a. The clonogenic assay demonstrated a significant antiproliferative effect of IP-Se-06 (p<0.001). Furthermore, the presence of the MEK inhibitor (U0126) caused a synergistic effect in cells also exposed to IP-Se-06 causing a significant reduction in the number of colonies. Inhibition of the MEK pathway by IP-Se-06 was proven by the decrease in ERK 1/2 levels. Furthermore, IP-Se-06 decreased the levels of p-p38, NRLP3 and caspase-1, reducing the inflammatory response triggered by the inflammasome complex. The in vivo results (Ehrlich ascitic tumor) showed inhibition of tumor growth (42%), increased animal survival (49.43%) and decreased angiogenesis (p<0.05) in animals treated with the compound IP- Se-06 at a concentration of 1mg/kg. It was observed that the compound IP-Se-06 was not able to change the plasma glucose levels when compared to the control. Finally, the predictions of ADMET together with the results obtained so far point to IP-Se-06 as a promising lead compound for the development of a possible antitumor drug; however, the need for future structural changes is highlighted.