Simultaneous encapsulation of sodium diethyldithiocarbamate and 4-nitrochalcone in solid lipid nanoparticles by water/oil/water double emulsion for biomedical aplication

Abstract

A nanoencapsulação de compostos terapêuticos visa o aumento da biodisponibilidade e atividade terapêutica bem como, a diminuição de possíveis efeitos colaterais. Dada a necessidade do desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas alternativas e mais eficientes, o presente trabalho tem como objetivo a encapsulação simultânea de dietilditiocarbamato de sódio e 4-nitrochalcona em nanopartículas lipídicas sólidas (SLNs) através do método de dupla emulsão água/óleo/água sem a utilização de solventes, visando a obtenção de efeito sinérgico entre os fármacos, para elaboração de um sistema terapêutico alternativo para o tratamento do melanoma (B16F10) e leishmaniose cutânea. A produção das SLNs foi realizada combinando os métodos de dupla emulsão W/O/W e dispersão por fusão sem a aplicação de solvente, utilizando cera de abelha e crodamol como matriz lipídica. As SLNs apresentaram características desejáveis para sua internalização celular com Dp médio abaixo de 250 nm, PDI indicando distribuição relativamente monodispersa e potencial zeta negativo antes e após liofilização além de morfologia semiesférica e baixa razão de aspecto. A encapsulação simultânea de DETC e 4NC pelo método de dupla emulsão W/O/W foi realizada com sucesso, apresentando alta eficiência de encapsulação, superior a 86% e 98% para os fármacos hidrofílico e hidrofóbico, respectivamente, tanto na forma isolada como na forma conjunta. A presença dos agentes fluorescentes hidrofílicos e hidrofóbicos na mesma estrutura, bem como sua internalização por células B16F10 pôde ser confirmada por microscopia de fluorescência. Os estudos de hemólise revelaram que mesmo em altas concentrações as SLNs puras não apresentaram efeito hemolítico superior a 5%. Os ensaios de viabilidade celular utilizando células B16F10 revelaram um maior efeito citotóxico dos fármacos quando encapsulados em comparação com a sua forma livre. A combinação de DETC+4NC apresentou efeito sinérgico nas formas livre e encapsulada, com um decréscimo na viabilidade celular de 45% e 64% respectivamente. Quando testadas em macrófagos peritoneais as SLNs se mostraram capazes de proteger as células do efeito citotóxico causado pelos fármacos na forma livre. Quando expostas à combinação de DETC+4NC as células de macrófago sofreram efeito inibitório sinérgico (92.2%). As SLNs não foram capazes de proteger as células apenas na maior concentração combinada (1.71DETC/0.884NC µg/mL). Os ensaios utilizando Leishmania amazonensis na forma promastigota revelaram que quando encapsulado o DETC tem seu potencial inibitório diminuído em relação a sua forma livre; a 4NC por sua vez teve efeito maior ao ser encapsulada (83.6%) quando comparada a forma livre (61.9%); a utilização de DETC+4NC não apresentou efeito sinérgico tanto na forma livre quanto encapsulada. Os resultados apresentados permitem concluir que a técnica de dupla emulsão água/óleo/água se mostra eficiente na encapsulação simultânea de fármacos hidrofílicos e hidrofóbicos bem como, na produção de nanopartículas lipídicas sólidas na ausência de solventes. A combinação de DETC+NC foi capaz de gerar efeito terapêutico sinérgico sobre células de melanoma e este ainda pode ser potencializado pela encapsulação simultânea nas SLNs. Os ensaios em macrófagos e Leishmania amazonensis revelaram que a encapsulação foi capaz de proteger as células de macrófagos e gerar efeito citotóxico sobre a forma promastigota, conferindo maior seletividade e efeito terapêutico às moléculas. Com base nos resultados obtidos, SLNs à base de cera de abelha contendo DETC e/ou 4NC pode ser uma alternativa viável para desenvolver a próxima geração de tratamentos para melanoma e leishmaniose cutânea.

Abstract: The nanoencapsulation of therapeutic agents allows to increase the bioavailability and therapeutic activity of the drug as well as reducing possible side effects associated with its use. Once that new alternative and more efficient therapeutic strategies are required, the aim of this work was the simultaneous encapsulation of sodium diethyldithiocarbamate and 4 nitrochalcone in solid lipid nanoparticles (SLNs) using water/oil/water double emulsion method in absence of organic solvents. In addition, the synergistic effect between the drugs was evaluated to propose an alternative therapeutic system for melanoma (B16F10) and cutaneous leishmaniasis. The production of SLNs was performed by combining the W/O/W double emulsion and melt dispersion technique in the absence of organic solvents and using beeswax and crodamol as lipid matrix. The SLNs presented desirable characteristics for cellular uptake such as Dp below 250 nm, PDI values indicating relatively monodisperse distributions and negative zeta potential, both before and after lyophilisation, allied to semi-spherical morphology and low aspect ratio. The simultaneous encapsulation of DETC and 4NC was successfully performed by the W/O/W double emulsion, with high encapsulation efficiency of more than 86% and 98% for the hydrophilic and hydrophobic drug, respectively, in both forms individually and simultaneously loaded. The presence of the hydrophilic and lipophilic fluorescent agents in the same structure as well as SLNs internalization by B16F10 cells was observed by fluorescence microscopy. Studies of hemolysis revealed that even at high concentrations, pure SLNs did not present hemolytic effect. Cell viability assays using B16F10 cells revealed a higher cytotoxic effect of the drugs when encapsulated in comparison with their free forms. The combination of DETC+4NC generated synergic inhibitory effect in both free (45%) and encapsulated (64%) forms. When tested in peritoneal macrophages SLNs demonstrated to be able to protect cells from the cytotoxic effect caused by the drugs. The combination of DETC+4NC had a synergistic inhibitory effect (92.2%) over macrophage cells. Only at the highest combined concentration (1.71DETC / 0.884NC µg/mL) SLNs were not able to protect the cells. The assays using the promastigote form of Leishmania amazonensis revealed that when encapsulated DETC has its inhibitory potential reduced relative to its free form. 4NC in turn had a greater effect when encapsulated (83.6%) compared to it free form (61.9%). The use of DETC+4NC showed no synergistic effect over L. amazonensis in both free and encapsulated form. The results show that the water/oil/water double emulsion technique is efficient in the simultaneous encapsulation of hydrophilic and hydrophobic drugs as well as in the production of solid lipid nanoparticles in the absence of organic solvents. The combination of DETC+4NC was able to generate synergic therapeutic effect on melanoma cells and this could be further potentialized by the simultaneous encapsulation in SLNs. Macrophage and L. amazonensis assays revealed that encapsulation was able to simultaneously protect macrophage cells and generate cytotoxic effect on the promastigote form, conferring greater selectivity and therapeutic effect to the molecules. Based on these results, beeswax SLNs containing DETC and/or 4NC may be a viable alternative for develop the next generation of melanoma and cutaneous leishmaniasis treatment.