Laccase immobilization on polyacrylonitrile particles

Abstract

Este trabalho possui como objetivo principal imobilizar a lacase (Lac) de Trametes versicolor em partículas de poliacrilonitrila (PAN) sintetizadas via polimerização em lama. Na primeira etapa do trabalho, foram produzidas partículas de PAN e suas propriedades morfológicas, texturais e estruturais foram analisadas por microscopia ótica, Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR) e fisissorção de nitrogênio, com o intuito de identificar as técnicas mais apropriadas de imobilização enzimática em consonância com as características do suporte. As partículas foram quimicamente modificadas em quatro etapas: hidrólise alcalina, hidrólise ácida, aminação e aplicação de Glutaraldeído (Glu) como agente reticulante. Nestas etapas, foram testados o tempo de reação com o NaOH (na hidrólise alcalina) ? 1; 2 e 3 horas, e a concentração de Glu (2; 4; 6; 8 e 10 % v/v). O tempo de reação em solução alcalina na primeira etapa da funcionalização que melhor representou alterações químicas no suporte foi o de 2 horas, enquanto a concentração de glutaraldeído não exerceu influência no rendimento de imobilização. A concentração de enzima, testada em 0,1; 0,25 e 0,5 mg/mL, também não apresentou influência significativa na imobilização. Ademais, o rendimento de imobilização foi de 99,48 e 14,29 % com o uso das partículas funcionalizadas e não funcionalizadas, respectivamente. A última etapa do trabalho consistiu na determinação de propriedades bioquímicas, químicas e físicas da lacase na sua forma livre e imobilizada por ligação covalente. Em geral, o derivado PAN+Lac exibiu bons resultados de atividade relativa e estabilidade na reação de oxidação do 2,2?-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato) (ABTS) em diferentes pHs e temperaturas testados, exceto quando as condições impostas atingiram pH 8 e 70 °C. Nestas condições, ambas as enzimas (livre e imobilizada) perderam sua atividade vertiginosamente. Além disso, a lacase imobilizada foi capaz de reter aproximadamente 89 % da atividade inicial após 30 dias de armazenamento sob refrigeração a 5 °C. Também foi possível reutilizar o biocatalisador heterogêneo mantendo sua atividade inicial em até 50 % por 5 ciclos. Portanto, é possível apontar que o método de síntese foi eficiente para produção de partículas de PAN que, por sua vez, foram aplicadas com sucesso como suporte para imobilização da lacase de Trametes versicolor por ligação covalente. Estes resultados mostraram a potencialidade deste biocatalisador heterogêneo frente a aplicações de interesse industrial.

Abstract: The main objective of this work was to immobilize laccase (Lac) from Trametes versicolor in polyacrylonitrile (PAN) particles synthesized via slurry polymerization. In the first stage of the study, PAN particles were produced and their morphological, textural, and structural properties were analyzed by optical microscopy, Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR), and nitrogen physisorption, to identify the most appropriate techniques for enzymatic immobilization in line with the characteristics of the support. The particles were chemically modified in four steps: alkaline hydrolysis, acid hydrolysis, amination, and application of Glutaraldehyde (Glu) as a crosslinking agent. In these steps, the reaction time with NaOH (in alkaline hydrolysis) ? 1; 2, and 3 h, and the Glu concentration (2; 4; 6; 8 and 10 % v/v) were tested. The reaction time in alkaline solution in the first part of the functionalization that bestrepresented chemical changes in the support were 2 h, while the glutaraldehyde concentration did not influence the immobilization yield. The enzyme concentration, tested at 0.1, 0.25, and 0.5 mg/mL, also showed no significant influence on immobilization. In addition, the immobilization yield was 99.48 and 14.29 % with the use of functionalized and nonfunctionalized particles, respectively. The last stage of the work consisted of the determination of biochemical, chemical, and physical properties of the laccase in its free form and immobilized by a covalent bond. In general, the PAN+Lac derivative exhibited good relative activity and stability results in 2,2?-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) oxidation reaction at different pHs and temperatures tested, except when the imposed conditions reached pH 8 and 70 °C. In these conditions, both enzymes (free and immobilized) dramatically lost their activity. Furthermore, the immobilized laccase was able to retain approximately 89 % of the initial activity after 30 days of refrigerated storage at 5 °C. In operational stability tests, it was also possible to reuse the enzymatic derivative maintaining its initial activity at up to 50 % for 5 cycles. Therefore, it is possible to point out that the polymer synthesis method was efficient for the production of PAN particles, which, in turn, were successfully applied for the immobilization of Trametes versicolor laccase by covalent bonding. These results showed the potential of this heterogeneous biocatalyst for applications of industrial interest.