Desenvolvimento de extratos padronizados de Ilex paraguariensis A. St.-Hil. com potencial atividade de captação de radicais livres e ação anti-inflamatória

Abstract

As folhas de Ilex paraguariensis (erva-mate) vêm sendo utilizadas há séculos pela população sob a forma de chimarrão, impulsionando pesquisas sobre seu potencial biológico e seus constituintes químicos. Nesse sentido, o objetivo dessa Tese foi de desenvolver extratos padronizados de erva-mate com potencial atividades anti-inflamatória e de captação de radicais livres. Para isso foram preparados 8 extratos utilizando diferentes combinações de variáveis: método de extração [infusão (I) e turboextração (T)], líquido extrator [água (A) e hidroetanólico (E)] e método de secagem [liofilização (L) e nebulização por spray drying (S)]. Os extratos foram caracterizados quimicamente por cromatografia liquida de ultra eficiência (CLUE ou LC) acoplado a detector DAD e massas (MS), e pelo teor de compostos fenólicos utilizando dois métodos colorimétricos, Folin-Ciocalteu (FC) e Fast-Blue (FBBB). A avaliação das atividades anti-inflamatória e de captação de radicais livres destes extratos padronizados foi conduzida com metodologias in vitro. A atividade de captação de radicais livres foi utilizada a metodologia por DPPH, enquanto que para a atividade anti-inflamatória foi avaliada pelo doseamento do NOx, TNF-a e IL-6 em células de macrófagos. Na análise por LC/MS os constituintes majoritários identificados foram: ácido cítrico, ácido clorogênico, ácido criptoclorogênico, ácido neoclorogênico, ácido ferroilquínico, ácido quínico, cafeína, cafeoilglicose, kampferol-raminosideo, quercetina 3-O-glicosideo, rutina e teobromina. E na análise por LC/DAD os constituintes majoritários quantificados foram: ácido clorogênico, ácido criptoclorogênico, ácido neoclorogênico, cafeína, rutina e teobromina. O teor de fenólicos totais, variou entre 163 a 313 mg EAC.g-1 de extrato seco para a técnica por Folin Ciocalteu e de 248 a 893 mg EAC.g-1 de extrato seco por Fast Blue BB. Dentre os extratos avaliados, o extrato IAS (Infusão Aquosa seca por spray drying) apresentou a menor EC50 na captação de radicais livres quando comparada aos demais extratos. Adicionalmente, os compostos majoritários presentes nos extratos foram avaliados quanto a atividade de captação de radicais livres, sendo o ácido neoclorogênico o composto que apresentou a menor EC50 (18,72 µg.mL-1). Na avaliação da atividade anti-inflamatória, a determinação de secreção do NOx indicou que os extratos IAS e IES apresentaram os maiores percentuais de inibição (50,10 e 53,57%). Os seis compostos avaliados na concentração presente no extrato da IAS (3 ug/ml) apresentaram atividade sobre a inibição da secreção do NOx, com destaque para a teobromina. Outro parâmetro avaliado na atividade anti-inflamatória foi a inibição do TNF-a pelos extratos secos por spray drying e pelos compostos isolados, sendo possível observar que o método de preparo influenciou na redução do TNF-a, visto que os extratos preparados por turboextração (TAS e TES) apresentaram os melhores resultados (inibição de 63,15 e 67,10%, respectivamente). Os compostos também foram avaliados na inibição do TNF-a e todos eles foram capazes de reduzir os níveis deste parâmetro. Por fim, a secreção do IL-6 foi avaliada nos extratos secos por spray drying, sendo os extratos IAS e TAS as amostras que apresentaram os maiores percentuais de inibição na dose de 30 µg mL-1 (62,43 e 52,91%). De acordo com os resultados obtidos em nosso trabalho, o extrato preparado por infusão aquosa e seco por nebulização apresentou os melhores resultados de atividade anti-inflamatória, captação de radicais livres e teor fenólicos totais. Além disso, todos os principais marcadores químicos presentes nesse extrato mostraram uma forte atividade de inibição de NOx e TNF-a, sugerindo que as atividades biológicas aqui detectadas estejam relacionadas à composição química e ao teor de marcadores químicos presentes nos extratos de I. paraguariensis.

Abstract: The leaves of Ilex paraguariensis (yerba mate) have been used for centuries by the population in the form of mate, boosting research on its biological potential and its chemical constituents. In this sense, the objective of this thesis was to develop standardized extracts of yerba mate with potential anti-inflammatory and free radical scavenging activities. For this, 8 extracts were prepared using different combinations of variables: extraction method [infusion (I) and turbo-extraction (T)], extractor liquid [water (A) and hydroethanolic (E)] and drying method [lyophilization (L) and nebulization by Spray Drying (S)]. The extracts were chemically characterized by ultraperformance liquid chromatography (CLUE) coupled to a PDA detector, and by the content of phenolic compounds using two colorimetric methods, Folin-Ciocalteu (FC) and Fast-Blue (FBBB). The evaluation of the anti-inflammatory and free radical scavenging activities of these standardized extracts was conducted with in vitro methodologies. The anti-inflammatory activity was evaluated by measuring NOx, TNF-a and IL-6 in macrophage cells, while the DPPH methodology was used to evaluate the free radical scavenging activity. In the LC/DAD analysis, the major constituents identified were: chlorogenic acid, cryptochlorogenic acid, neochlorogenic acid, caffeine, rutin and theobromine. The total phenolic content ranged from 163 to 313 mg EAC.g-1 of dry extract for the technique by Folin Ciocalteu and from 248 to 893 mg EAC.g-1 of dry extract by Fast Blue BB. Among the extracts evaluated, the IAS extract (Aqueous Infusion Spray drying) showed the lowest EC50 in the capture of free radicals in relation to the other extracts whose EC50 was 54.43 ± 5.14 µg mL-1. Additionally, the major compounds present in the extracts were evaluated for free radical scavenging activity, with neochlorogenic acid being the compound that presented the lowest EC50 (18.72 µg mL-1). In the evaluation of anti-inflammatory activity, the determination of NOx secretion indicated that the IAS and IES extracts showed the highest percentages of inhibition (50.10 and 53.57%). The 6 compounds evaluated at the concentration present in the IAS extract at the lowest dose (3 ug/ml) showed activity on the inhibition of NOx secretion, with emphasis on theobromine. This indicates that the compounds are related to the results found for the extract. Another parameter evaluated in the anti-inflammatory activity was the TNF-a in the extracts dried by Spray drying and, in the compounds, and it was possible to observe that the preparation method influenced the reduction of TNF-a, and the extracts prepared by turboextraction (TAS and TES) had the best results (63.15 and 67.10%). And the compounds were also evaluated in the inhibition of TNF-a and all of them were able to reduce the levels of TNF-a. Finally, IL-6 secretion was evaluated in the dried extracts by Spray drying, and the solvent used and the drying method influenced the reduction of IL-6 secretion, so that IAS and TAS showed the highest percentages of inhibition at the highest dose of 30 µg mL-1 (62.43 and 52.91%). According to the results obtained in our work, the extract prepared by aqueous infusion and dried by Spray drying showed the best results in anti-inflammatory activity, free radical scavenging and total phenolic content. Furthermore, all the main chemical markers present in this extract showed strong NOx and TNF-a activity, suggesting that the biological activities detected here are related to the chemical composition and content of chemical markers present in the I. paraguariensis extract.