Triagem de análogos de 1,4-dihidropiridina em condições de cultura tumoral em matriz Cellfate®

Abstract

A crescente resistência das células neoplásicas à atual geração de agentes quimioterápicos, a deficiência nas análises pré-clínicas em cultura 2D e os problemas quanto à eficácia e segurança não previstas nos testes em animais, têm sido fonte propulsora para investigação de novos agentes terapêuticos como possíveis alternativas aos tratamentos do câncer. O reposicionamento de fármacos contendo o núcleo 1,4-dihidropiridina (DHP) tem chamado a atenção por seus efeitos citotóxico, redutor de danos e estimulador do reparo de DNA em células humanas, bem como potencial antidiabético, antimicrobiano e antioxidante. Com base nesses estudos, esta pesquisa teve por objetivo avaliar a citotoxicidade de compostos análogos de DHP em culturas bidimensional e tridimensional, fazendo essa correlação a partir dos ensaios de viabilidade (MTS) e morfologia celular (MCVL).Foram então utilizados quatorze análogos de DHPs sobre três linhas de células cancerígenas (A549, SKMEL-28 e GL-261) e um controle não tumoral (L929). A seleção prévia dos compostos foi feita em cultura 2D com base na redução mínima de 50% da atividade metabólica das células endoteliais e tumorais na presença dos DHPs (50 µM). Nesta etapa foram selecionados apenas a L929, SKMEL-28 e GL-261 que, cultivadas em ambiente 2D, sofreram redução mínima de 50% na atividade metabólica sob a ação de 5 compostos, sugerindo-os como bons candidatos para a sequência do estudo. Subsequente a isso, foi determinada a concentração inibitória mínima (IC50) para as células e compostos selecionados ainda em cultura 2D. Com base nos resultados, foram apresentadas as seguintes concentrações dos compostos (CP) nas respectivas células L929, SKMEL-28 e GL 261: CP2 (48,33µM, 100,22µM, 19,14µM); CP10 (51,6 µM, 56,07 µM, 24,91 µM); CP12 (157,41µM, 119,57µM, 33,86µM); CP13 (83,65µM, 138,1µM, 40,46µM); CP14 (47,6µM, 61,25µM, 29,25µM). Para análise do efeito da concentração do composto em cultura 2D e 3D, foram comparados os resultados em 2D (placa) com dois tipos de matrizes derivadas de nanocelulose bacteriana, CellFate® pura e tratada com colágeno, doadas pela empresa Biocelltis Biotecnologia S.A. Dentre as células estudadas a GL-261 apresentou a maior sensibilidade aos compostos em cultura 2D, enquanto em 3D não houve citotoxicidade para a mesma concentração usada. Dentre os compostos selecionados, o composto 2 apresentou um comportamento particular com citotoxicidade semelhante para célula SKMEL-28 nas três condições de cultivo. A maioria dos compostos tiveram sua atividade citotóxica reduzida sob o cultivo nas plataformas tridimensionais em comparação com o cultivo em placas, possibilitando uma representatividade maior das células neoplásicas e melhor compreensão da sua resistência aos agentes quimioterápicos quanto às análises pré-clínicas ineficientes em cultura 2D. Assim este estudo auxilia na exploração de potenciais microambientes de cultivo celular voltados para triagem de fármacos, contribuindo às pesquisas de desenvolvimento de modelos tumorais para avaliação pré-clínica in vitro, visando a eficácia dos medicamentos a serem desenvolvidos contra o câncer. Enfatiza a necessidade de estratégias sobre o direcionamento das potencialidades dos mais diversos análogos de DHP voltados às interações entre as células tumorais e os fatores microambientais promotores de tumores partindo de simulações mais fiéis do mecanismo celular nativo.

Abstract: The growing resistance of neoplastic cells to the current generation of chemotherapeutic agents, the deficiency in preclinical analyzes in 2D culture and the problems regarding the unforeseen efficacy and safety of animal tests, have been a driving source for the investigation of new therapeutic agents as possible alternatives to cancer treatments. The repositioning of drugs containing the 1,4-dihydropyridine (DHP) nucleus has drawn attention for its cytotoxic, damage-reducing and DNA repair stimulator effects in human cells, as well as antidiabetic, antimicrobial and antioxidant potential. Based on these studies, this research aimed to evaluate the cytotoxicity of DHP analog compounds in 2D and 3D culture models, making this correlation from the viability assays (MTS) and cell morphology (MCVL) in order to study the cytotoxic influence of these compounds. Therefore, fourteen DHP analogues were used on three cancer cell lines (A549, SKMEL-28 and GL-261) and a non-tumor control (L929).Previous selection of evaluated compounds was performed in 2D based on a minimum reduction of 50% of the metabolic activity of endothelial and tumor cells in the presence of DHPs (50 µM). At this stage, only L929, SKMEL-28 and GL-261 were selected, which, cultivated in a 2D environment, underwent a minimum reduction of 50% in metabolic activity under the action of 5 compounds, suggesting them as good candidates for the study sequence. Subsequently, the minimum inhibitory concentration (IC50) for selected cells and compounds still in 2D was determined. Based on the results, the following concentrations of compounds (CP) in the respective L929, SKMEL-28 and GL 261 cells were presented: CP2 (48.33 µM, 100.22 µM, 19.14 µM); CP10 (51.6 µM, 56.07 µM, 24.91 µM); CP12 (157.41 µM, 119.57 µM, 33.86 µM); CP13 (83.65 µM, 138.1 µM, 40.46 µM); CP14 (47.6 µM, 61.25 µM, 29.25 µM). To analyze the effect of the compounds concentration in 2D and 3D cultures, the results in 2D (plate) were compared with two types of matrices derived from bacterial nanocellulose, pure CellFate® and CellFate® treated with collagen, donated by the company Biocelltis Biotecnologia S.A. Among the cells studied, GL-261 showed the highest sensitivity to compounds in 2D culture, while in 3D there was no cytotoxicity for the same concentration used. Among the selected compounds, the compound 2 showed a particular behavior with similar cytotoxicity to SKMEL-28 in the three culture conditions. Most compounds had their cytotoxic activity reduced under cultivation on three-dimensional platforms compared to cultivation on plates, allowing a greater representation of neoplastic cells and a better understanding of their resistance to chemotherapeutic agents regarding inefficient preclinical analysis in 2D culture. Thus, this study helps in the exploration of potential cell culture microenvironments aimed at drug screening, contributing to research into the development of tumor models for pre-clinical in vitro evaluation, aiming at the effectiveness of drugs to be developed against cancer. It emphasizes the need for strategies to target the potential of the most diverse DHP analogues aimed at interactions between tumor cells and microenvironmental factors that promote tumors, starting from more faithful simulations of the native cell mechanism.